Introducción

El venado cola blanca (Odocoileus virginianus) es una especie de gran importancia ecológica y socioeconómica en México (^{Clemente et al., 2015}). Por ello, aspectos como la productividad y los niveles hormonales deben ser atendidos para un mejor manejo de la especie (^{Shipka et al., 2007}), ya sea para la conservación o para su aprovechamiento (^{Pelletier et al., 2003}). Las hormonas regulan la fisiología y el comportamiento de los individuos, así como el crecimiento, la condición corporal, el comportamiento social, y sobre todo, la reproducción (^{Morden et al., 2011}). En cérvidos presentes en áreas templadas y frías, el fotoperiodo influye en la producción hormonal, ya que es el responsable de la adaptación de los cérvidos a altas latitudes, presentándose la época reproductiva cuando el fotoperiodo disminuye y las hormonas reproductivas se incrementan (^{García et al., 2005}). En la mayor parte de los mamíferos, el fotoperiodo es la señal ambiental más importante para la determinación de la estación reproductiva, y en especies con reproducción estacional la luz es el factor ambiental determinante de sus ciclos reproductivos dado que estos animales utilizan la variación de las horas luz para conocer el momento del año en que se encuentra (^{Pérez, 2014}).

Se ha observado también que los cambios estacionales en la disponibilidad de vegetación y su calidad pueden afectar el nivel de producción de glucocorticoides en venado cola blanca (^{Millspaugh & Washburn, 2004}). El venado cola blanca es una especie muy sensible y es fácilmente estresado por disturbios causados por las actividades humanas, incluso aquellas asociadas a la actividad cinegética, la recreación o el ecoturismo, provocando alteraciones en su producción hormonal (^{Brown et al., 2012}). Dicha situación tiene implicaciones económicas y de conservación, por lo que existe el interés de conocer que factores tienen influencia sobre la producción hormonal y mitigar aquellos causantes de estrés o que tengan efectos deletéreos sobre las poblaciones (^{Millspaugh & Washburn, 2004}).

Aunque no se conocen bien los efectos del estrés sobre la fauna silvestre, existen investigaciones que sugieren un posible efecto fisiológico deletéreo a largo plazo (^{Brown et al., 2012}). La secreción de los glucocorticoides ocurre durante una respuesta al estrés, la cual habilita al animal a enfrentarse al estrés movilizando la energía requerida para la respuesta y minimizando el gasto de energía en tejidos que no son necesarios para la sobrevivencia inmediata (^{Huber et al., 2003a}). Respecto a la relación de los glucocorticoides con la testosterona, se cree que los glucocorticoides tienen un efecto de supresión en la producción de andrógenos (^{McCoy & Ditchkoff, 2012}). La testosterona, junto con el estradiol, son un grupo de hormonas esteroides sexuales muy importantes ya que no solo regulan los patrones reproductivos en hembras y machos en la época reproductiva, sino también regulan aspectos de comportamiento sexual y fisiológicos (ej. producción de astas) durante la vida de los individuos (^{Soto et al., 2004}). Anteriormente, los niveles hormonales se han medido mediante muestras sanguíneas, lo cual requiere de la contención y captura de los animales, sin embargo, esas actividades son detonantes de estrés (^{Kapke et al., 1999}). El estrés causado por la captura puede afectar el muestreo sanguíneo al modificarse las concentraciones de las hormonas, en consecuencia, las mediciones hormonales pueden volverse sesgadas (^{McCoy & Ditchkoff, 2012}). Dado que las heces pueden ser colectadas sin perturbar y estresar a los individuos, se ha vuelto una técnica de muestreo muy común en estudios de comportamiento, ecología y genotipificación (^{Huber et al., 2003b}).

Las poblaciones de venado cola blanca presentes en la Sierra Madre Occidental del Estado de Durango han sido poco estudiadas desde el punto de vista hormonal. Al mismo tiempo, algunos productores han colocado cercado con la intención de iniciar o intensificar la producción o actividad cinegética de venado en sus propiedades. Se cree que una población en encierro y su contacto frecuente con personas y sus actividades, podría producir mayores niveles de cortisol en heces, y esto a su vez, afectar la reproducción. Por su parte, la cobertura vegetal, traducida como disponibilidad de alimento y protección para venado, podría ser una de las principales variables ambientales promotora de estrés en las poblaciones de venado cola blanca, tanto en vida libre como en cautiverio. Por lo anterior, los objetivos planteados en este estudio fueron: 1) identificar el sexo de los individuos que produjeron las heces fecales mediante amplificación de Ácido Desoxirribonucléico (DNA) fecal, 2) determinar los niveles de cortisol, testosterona y el estradiol en heces de venado cola blanca en dos poblaciones, tanto en vida libre como en encierro, 3) hacer un análisis correlacional entre hormonas y variables ambientales de cada sitio para conocer si algún factor ambiental está provocando estrés y, 4) comparar los niveles hormonales entre poblaciones, sexos y épocas del año.

Material y Métodos

Identificación de sexo a partir del DNA en heces

Para identificar el sexo de los individuos que produjeron los grupos fecales, se amplificó un fragmento del gen SRY mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con el par de iniciadores: SRY forward CAT CTT GTC TGT GTG TCG TG y SRY reverse: CGG GTA GTG TCG TTT GTC TA (^{Lounsberry et al., 2015}). Se utilizaron tres muestras de tejidos provenientes de venados machos adultos cazados en la UMA Salvador Allende como controles positivos. Las concentraciones finales para la reacción de PCR fueron 100-150 ng/μL de DNA, 2.5 mM MgCl_2, 0.5 mM dNTP’s, 0.6 pM de iniciadores de PCR y 0.750 unidades de Taq DNA polimerasa. Las condiciones de PCR fueron 3 min a 95 °C de desnaturalización inicial, 35 ciclos de 30 s a 94 °C, 1.30 min a 58 °C, 1 min a 72 °C, finalmente, 10 min a 72 °C de elongación final. Cada evento de reacción de PCR incluyó un control positivo y un control negativo (sin DNA). Los productos de PCR fueron observados en geles de agarosa al 1 % teñidos con bromuro de etidio. En cada gel se agregó marcador de peso molecular y controles positivo y negativo. Para asegurar los resultados, las extracciones de DNA, reacciones de PCR, y la observación de los productos en gel se llevaron a cabo por duplicado. Las muestras que no mostraron amplificación se tomaron como hembras, mientras que las muestras que mostraron una banda (~200 pb) se tomaron como machos (Figura 1). Las muestras que mostraron bandas difusas no se tomaron en cuenta para el estudio.

Figura 1 Gel de agarosa con las amplificaciones del marcador del gen SRY para la identificación del sexo en las muestras. Las muestras 2, 3, 4 y 5 son de DNA en heces. Las muestras 6 y 7 son de DNA de tejidos. (MP=marcador de peso molecular, M=macho, H=hembra). 

Análisis estadístico

Con el objetivo de conocer las diferencias en los niveles de las hormonas esteroides entre sexos y entre UMA en cada estación del año, se llevó a cabo un análisis de varianza (ANOVA) factorial donde los factores fueron, UMA, estación y sexo (procedimiento GLM, SAS Institute 9.2, Cary, NC, USA). Además, se obtuvo el coeficiente de correlación de Pearson para relacionar la cantidad de hormonas (cortisol, testosterona o estradiol) por cada UMA con sus variables ambientales como temperatura, precipitación, fotoperiodo y cobertura vegetal (procedimiento Corr, SAS Institute 8.0, Cary, NC, USA).

Resultados y Discusión

Se colectó un total de 385 de heces frescas en ambas UMA abarcando todas las estaciones (Tabla 1). Mediante la amplificación del fragmento del gen SRY, se identificaron 219 heces como hembra y 166 como machos (Tabla 1). La relación macho: hembra para Salvador Allende fue 1:2.02 y para Molinillos 1:1.12. En general, los niveles de cortisol, testosterona y estradiol en heces se incrementaron conforme las estaciones avanzaron al invierno y el fotoperiodo disminuyó (Figura 2). Se encontraron correlaciones negativas significativas entre estradiol con temperatura y fotoperiodo en la SA (Tabla 2). Por su parte, para MO, se observó una correlación negativa entre el cortisol con temperatura y fotoperiodo, testosterona con temperatura y fotoperiodo, estradiol con temperatura y fotoperiodo (Tabla 2). Las características ambientales estacionales para cada UMA se muestran en el Tabla 3. El aumento en los niveles hormonales en heces coincide con la disminución del fotoperiodo y la presencia de la época reproductiva (otoño-invierno). Esto es porque el fotoperiodo es el principal mecanismo ambiental que controla los cambios estacionales mediante la regulación del eje hipotálamo-hipófisis-gónadas (^{Li et al., 2001}) ya que la glándula pineal funciona como un traductor neuroendocrino de la variación circadiana y circanual del fotoperiodo y produce melatonina en respuesta de la oscuridad, y altos niveles de melatonina eleva la producción de hormonas esteroides reproductivas (^{Bubenik, 2006}). La estrategia de adaptación al fotoperiodo, asegura que la preñez y el periodo de lactancia coincidan con el periodo donde existe la mayor fuente y variedad de alimento (^{Li et al., 2001}).

Figura 2 Niveles medios por estación de cortisol, testosterona y estradiol en heces de venado cola blanca de dos Unidades de Manejo para la Conservación de Vida Silvestre (UMA) en Durango, México. La misma letra sobre barras con mismo fondo indica no diferencias significativas. (Cortisol F3,103=16.28, p<0.0001, testosterona F3,103=3.73, p=0.0136, estradiol F3,103=6.68, p=0.0004). 

Respecto a la vegetación, no se encontró correlación entre las hormonas esteroides y la cobertura vegetal en SA. Sin embargo, se observó correlación negativa entre la cobertura vegetal y cortisol, testosterona y estradiol en MO (Tabla 2). Los niveles de cortisol pueden ser influenciados por la dieta y el tipo de vegetación. Durante el invierno, los cérvidos que viven en áreas templadas tienen que lidiar con una reducida abundancia de plantas y la baja calidad del forraje, y a su vez, con altas demandas de energía causadas por la termorregulación y locomoción (^{Taillon & Côté, 2008}). Cuando la condición corporal es baja, los herbívoros utilizan las reservas corporales y las proteínas de los músculos para sobrevivir, esto eleva la secreción de los glucocorticoides, dado que movilizan las reservas energéticas necesarias para enfrentar las condiciones ambientales (^{Huber et al., 2003a}). En este estudio, los niveles de cortisol en las heces no fueron diferentes entre las poblaciones para el otoño y el invierno. Sin embargo, en la primavera y el verano, la población en vida libre tuvo niveles más altos de cortisol en heces y la cobertura vegetal fue menor en ésa época, aunque la correlación no fue significativa estadísticamente (Tabla 4).

El nivel medio de cortisol en heces fue mayor en SA que en MO (F_1,103=31.87, p<0.0001) (Figura 3). Esas diferencias fueron más evidentes en primavera y verano (F_3,103=8.17, p<0.0001) (Tabla 4). Por las condiciones del encierro, se esperaba que los niveles de cortisol fueran más altos en MO. ^{Millspaugh & Washburn (2004)} observaron que animales silvestres que se han sometido al encierro pueden producir mayor cantidad de glucocorticoides que los animales en vida libre. Esto es porque un poco antes de que se produzca una situación de estrés, el eje hipotálamo-pituitaria-adrenal se activa y los resultados son la alta producción de glucocorticoides (He et al., 2004) pero, conforme el tiempo avanza y las condiciones causantes de estrés continúan, el cuerpo puede crear una respuesta regulatoria de tal manera que la producción de glucocorticoides se disminuye debajo de los niveles normales y pueden reflejar la etapa final del estrés en los animales que han sido criados en cautiverio desde el nacimiento (^{Linklater et al., 2010}).

Este fenómeno podría ser una explicación para la población en Molinillos, dado que esta población se ha mantenido 13 años en encierro natural. Sin embargo, He et al. (2004) observaron que en centros de reproducción de ciervo almizclero (Moschus sp.) en semi-cautiverio o encierros naturales, los individuos mostraron menos comportamiento asociado al estrés (ej. agitación e hipersensibilidad) que aquellos que vivían en cautiverio. Entonces, se sugiere que los ambientes creados en los encierros naturales no son perjudiciales en ciervo almizclero (^{Liu et al., 2010}). A diferencia de MO, en SA está permitida la actividad cinegética, y entonces los niveles de cortisol en heces en esta UMA podrían haber sido afectados por esta actividad. Esto puede sugerir que las condiciones de encierro natural mantenidas en Molinillos no están generando altos niveles de estrés, y probablemente la densidad poblacional aún no es lo suficientemente alta para afectar la producción de hormonas de estrés.

Se observó en los machos, que el cortisol disminuyó conforme la testosterona también disminuyó en ambas UMA (Tabla 4). También se observó en MO, correlación significativa entre testosterona y estradiol (Tabla 2). ^{McCoy & Ditchkoff (2012)} comentaron que la actividad reproductiva eleva los niveles de glucocorticoides en machos de venado cola blanca, así como ellos; ^{Pelletier et al. (2003)} observaron lo mismo en el borrego cimarrón (Ovis canadiensis) y ^{Chunwang et al. (2004)} en ciervo del padre David (Elaphurus davidianus). En este estudio se observó que los niveles más altos de cortisol en ambas UMA se presentaron antes de la época reproductiva y se mantuvieron en el invierno. Estos niveles altos de cortisol corresponden de igual manera a los niveles de testosterona (Tabla 4). El aumento en cortisol se atribuye al incremento de la testosterona, que a su vez, fomenta las interacciones agresivas entre los machos con el objetivo de establecer dominancia (^{Chunwang et al., 2004}). En el venado cola blanca, la competencia entre machos para aparearse con un mayor número de hembras en estro, mediante la intimidación de otros machos, ocurre al inicio de la época reproductiva para establecer o mantener sus jerarquías de dominancia y poder reproducirse (^{Ronsberry et al., 2001}; ^{Garcia et al., 2005}). Se ha observado que tanto los animales que ejercen dominancia como aquellos subordinados pueden presentar altos niveles de estrés y la producción de cortisol se eleva poco antes del inicio de la época reproductiva cuando las jerarquías son establecidas (^{Bartos et al., 2010}). En este estudio, esto se corrobora al observarse una correlación positiva entre el cortisol y la testosterona en heces en ambas poblaciones.

Respecto a los niveles de cortisol entre sexos, se observó que las hembras tuvieron niveles más altos que los machos (F_1,103=27.85, p<0.0001), especialmente en el verano y el invierno (F_3,103=3.46, p=0.0192) (Tabla 3). ^{Huber et al. (2003a)} observaron niveles más altos de metabolitos de cortisol en invierno (diciembre y enero) que en todo el resto del año en ciervo rojo, pero no encontraron diferencias significativas entre hembras y machos en algún mes en particular. Por otro lado, ^{He et al. (2014)} encontraron diferencias en los niveles de cortisol entre sexos para ciervo almizclero, los machos tuvieron significativamente menos glucocorticoides fecales que las hembras. ^{McCoy & Ditchkoff (2012)} observaron niveles más altos de glucocorticoides fecales en hembras de venado cola blanca antes de la época reproductiva y durante la época reproductiva. ^{Yoshimura et al. (2003)} mencionan que la diferencia en la actividad adrenocortical entre hembras y machos es común en varias especies. Esas diferencias pueden ser causadas por las hormonas reproductivas, los receptores de los glucocorticoides y sus proteínas de unión. Las diferencias entre sexos puede reflejar una diferencia en el metabolismo de los esteroides, las vías de excreción y la respuesta de la glándula pituitaria (^{Huber et al., 2003a}).

En este estudio se observó que las hembras mostraron más altos niveles de testosterona en heces que los machos en verano (F_3,103=5.79, p=0.0011) (Tabla 3). ^{López & Montes (2016)} observaron una cantidad mayor de metabolitos de testosterona fecal en hembras en venado cola blanca, aunque no fueron estadísticamente diferentes. Además encontraron que los machos produjeron más estradiol en la época no reproductiva, mientras que las hembras produjeron más estradiol en la época reproductiva. Los altos niveles de estradiol en los machos antes o durante la época reproductiva son explicados por la importancia que tiene esta hormona en la espermatogénesis (^{Garcia et al., 2005}). En la época no reproductiva (primavera y verano), el estradiol puede estar asociado con la producción, desarrollo y crecimiento de las astas. ^{Bubenik et al. (1997)} observaron que el crecimiento de las astas ocurría cuando las concentraciones de testosterona en sangre eran mínimas, pero la hormona aumentaba rápidamente durante la fase de mineralización de las astas alcanzando un máximo poco antes de la época reproductiva. Entonces, el estradiol es la hormona más importante para el crecimiento y maduración de las astas. Aunque aún no se conoce exactamente la vía metabólica de acción, se cree que el estradiol podría estarse produciendo a partir de la aromatización de la testosterona (^{Bubenik et al., 2005}), por lo que, los niveles de testosterona en heces se reducen.

Los valores de los niveles de cortisol y testosterona en este estudio fueron bajos, aunque dentro de los rangos reportados en varios estudios realizados en venado cola blanca y otros cérvidos (^{Pelletier et al., 2003}; ^{Chunwang et al., 2004}; ^{McCoy & Ditchkoff, 2012}; ^{López & Montes, 2016}). Esto pudo haber ocurrido por la actividad microbiana presente en las heces, las cuales metabolizan las hormonas esteroides a metabolitos con los cuales no existió reacción cruzada con los anticuerpos utilizados en este estudio. Para este trabajo las heces se colectaron frescas pero tomó un par de horas transferirlas para su congelación. ^{Millspaugh & Washburn (2004)} comentaron que los metabolitos hormonales fecales pueden cambiar en periodos cortos de tiempo, especialmente cuando se calientan, se congelan y se descongelan. Cuando ^{Li et al. (2001)} obtuvieron bajos niveles de estradiol fecal en su trabajo, lo atribuyeron a la sensibilidad de la técnica utilizada o a que la hormona había sido metabolizada en las heces a otro esteroide que no tuvo reacción cruzada con el anticuerpo que ellos utilizaron.

Conclusiones

Las hormonas reproductivas, testosterona y estradiol, se elevaron durante la época reproductiva (otoño-invierno) y cuando el fotoperiodo disminuyó. El cortisol fecal se elevó en invierno dada la época reproductiva y las actividades relacionadas a ésta como la agresión entre machos, las bajas temperaturas, así como la baja cantidad y calidad del alimento disponible. El cortisol fecal fue más alto en la población en vida libre, indicando que las poblaciones en encierro natural no siempre son la causa de altos niveles de estrés cuando las condiciones de manejo son adecuadas. Bajo un manejo y monitoreo adecuados, los encierros naturales pueden llegar a ser una buena estrategia para el manejo y reproducción de venado cola blanca sin causar efectos deletéreos en esas poblaciones. Finalmente, existen varios factores como la composición de dieta, relaciones sociales intra y entre especies, y actividades humanas que provocan la elevación en los niveles de cortisol en las poblaciones de vida libre que deben ser estudiadas.