Cepas de Trichoderma

Las especies de Trichoderma se obtuvieron de la colección de cultivo de hongos del Laboratorio de Fitopatología del Departamento de Parasitología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, México, aisladas de suelos agrícolas de México. Los cultivos se reactivaron en medio de cultivo PDA y se incrementaron masivamente en semillas de arroz (^{Michel-Aceves et al., 2008}), las especies utilizadas fueron, T. harzianum, T. asperellum y T. longibrachiatum.

Aislamiento de Fusarium verticillioides

A final del ciclo Primavera-Verano específicamente al momento de la cosecha, se realizó un muestreo en la zona donde se establecería el experimento, a 110 días después de la siembra se recolectaron tallos y mazorcas de maíz criollo sintomáticas (os) y asintomáticas (os) para la obtención del fitopatógeno. Los tallos y las mazorcas se trasladaron al departamento de Parasitología y se sembraron fracciones de tejido y granos de maíz con síntomas característicos del hongo y asintomáticos en medio de cultivo Verde de Malaquita Agar (^{Leslie & Summerell, 2006}). La siembra se realizó de acuerdo a la metodología propuesta por ^{Agrios (2005)}.

Caracterización morfológica de Fusarium verticillioides como agente causal de la pudrición de mazorca

Las cepas fueron caracterizadas fenotípicamente de acuerdo con ^{Leslie & Summerell (2006)}, la purificación se llevó a cabo a partir de cultivos monoconidiales, los aislamientos fueron conservados a 4 °C hasta su utilización (^{Duarte et al., 2016}).

Caracterización molecular de F. verticillioides

El patógeno se cultivó en medio PDA por 10 días. La extracción de ADN se llevó a cabo mediante la metodología de ^{Nicholson et al. (2001)}. La integridad y calidad del ADN extraído se verificó en gel de agarosa al 1 %, mediante electroforesis horizontal a un voltaje de 100 volts durante 40 min. Se amplificó la región ITS1 e ITS4 (Internal Transcribed Spacer) utilizando los cebadores ITS1 (5’TCC GTA GGT GAA CCT GCG G3’) e ITS4 (5’TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3’), el volumen final de la reacción fue de 20 μL, se adicionó 13.58 de agua MQ, 2.0 μL de amortiguador MgCl (10X), 0.32 μL de MgCl₂ (25 mM), 0.4 μL de dNTP´s (10mM), 0.5 μL de los iniciadores ITS1 e ITS4 a 10μM, 0.5μL de DMSO, 0.2 μL de ADN Taq-polimerasa 1 U y 1 μL de ADN (40 ng/μL). Las condiciones de las reacciones de amplificación fueron: 1 ciclo de 94 °C 3 min, seguido de 35 ciclos a 94 °C 45s, 53 °C por 45s y 72 °C 1 min; finalizando con un ciclo de polimerización de 72 °C por 7 min. Las bandas amplificadas se observaron en gel de agarosa al 1.0 % a 90 V por 60 min.

Los productos de PCR fueron secuenciados por el laboratorio Macrogen (Rockville, USA). Las secuencias obtenidas fueron comparadas con las registradas en la base de datos del GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI), se utilizó la herramienta BLAST (Basic Local Aligment Search Tool) para secuencias altamente similares.

Suspensión de conidios de Trichoderma spp.

La suspensión de conidios de las especies de Trichoderma se obtuvo a partir de cultivos de 25 días de edad crecidos en granos de arroz a 26 °C, los conidios se recuperaron con agua destilada estéril, se filtraron con una gasa para separar el micelio y los conidios (^{Gato, 2010}), el filtrado se ajustó a la concentración de 1x10⁹ conidios/mL en una cámara Neubauer (Neubauer improved bright-line, Lo-Laboroptik).

Genotipos

Se utilizaron maíces criollos e híbridos con adaptación a zonas tropicales, los híbridos H-520 F1 y Mestizo Diamante fueron proporcionados por el Grupo Hernández Montiel y Asociados S.P.R de R.L., los criollos se adquirieron con productores de la zona de estudio y el material UAAAN-ISP-173 fue proporcionado por el Banco Nacional de Germoplasma de Maíces de México de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro conocido por ser tolerante a la invasión de Fusarium verticillioides.

Actividad del biocontrol in planta

La siembra de los maíces se realizó de forma manual en el ciclo Otoño-Invierno, bajo condiciones de temporal e infección natural de F. verticillioides, en surcos de 5 m de longitud, con 0.90 m entre surcos y 0.40 m entre plantas en la región Huasteca Veracruzana, en el ejido Chapopote II con coordenadas 21° 10´ 13.68´´ LN y 98° 13´ 36.09´´ LO. Se utilizó un diseño de bloques al azar con arreglo factorial A x B x C, con cuatro repeticiones por tratamiento (5 surcos/ repetición) y un testigo absoluto. En cada surco se sembraron 25 semillas inoculadas y sin inocular con Trichoderma spp., se depositaron dos semillas por golpe. La densidad de población fue de aproximadamente 55,555 plantas/hectárea.

Las especies de Trichoderma se inocularon por tres métodos diferentes; mediante tratamiento de inoculación de la semilla (TS), aspersión foliar (TA) y los dos métodos anteriores en combinación (TS+TA).

La dosis que se aplicó en el tratamiento de inoculación de semilla fue equivalente a 10 g/kg de semilla (^{Chandra et al., 2008}), primeramente la semilla se hidrató con agua por 12 h, como adherente se utilizó gel natural de sábila (Aloe vera).

La inoculación mediante aspersión se llevó a cabo cuando habían emergido más del 50 % de flores femeninas, en la etapa R1 se realizaron aplicaciones dirigidas a los estigmas en tres oportunidades, a una concentración de 1x10⁹ conidios/ mL repitiéndose cada tercer día, se suspendieron cuando la población se había uniformizado alrededor del 95 % de floración.

Efecto en la incidencia de pudrición de mazorca

A los 150 días después de la siembra se seleccionaron 20 plantas al azar de los tres surcos centrales de cada repetición, se cosecharon sus mazorcas para la evaluación de incidencia de pudrición, se contaron las mazorcas que presentaban síntomas de pudrición en las parcelas de cada uno de los tratamientos, los resultados se expresaron en porcentaje.

Determinación de severidad de pudrición de mazorca

Se cosecharon 20 mazorcas seleccionadas al azar de los tres surcos centrales. La severidad se determinó con la escala de ^{Reid et al. (1996)}. Tabla 1.

Análisis estadístico

La incidencia se procesó mediante análisis de varianza con arreglo factorial de tres factores (A x B x C), con tres niveles en el factor A, cuatro niveles en B y cuatro en C, en el factor A se ubicaron a los métodos, B fueron los genotipos usados en la investigación y C correspondió a las cepas de Trichoderma, su utilizó el programa SAS versión 9.0 para Windows, las medias fueron separadas por la prueba de Tukey al nivel de significancia de p = 0.05.

Los datos de severidad de la enfermedad se ajustaron a una media ponderada mediante la prueba de Friedman, con el programa SAS versión 9.0 para Windows.

Caracterización morfológica de Fusarium verticillioides como agente causal de la pudrición de mazorca

Después de 12 días de incubación de las muestras del hongo fitopatógeno se observó micelio extenso algodonoso en medio de cultivo, frecuentemente con algo de tinte rosa, purpura o amarillo en el medio. Se encontraron microconidios abundantes simples y en cadenas, generalmente hialinos unicelulares, bicelulares, con forma oval y de garrote y estaban generalmente aplanados en cada extremo. Los macroconidios, con paredes delgadas y su forma de curvos en forma de canoa a casi rectos; con 3-7 septos y la célula basal en forma de pie. Con ausencia de clamidosporas en el micelio, se identificó a F. verticillioides como causante de la pudrición de mazorca de acuerdo a características fenotípicas descritas por diferentes autores (^{Warham et al., 1996}; ^{Barnett & Hunter, 1998}; ^{Leslie & Summerell, 2006}).

Caracterización molecular de F. verticillioides

De acuerdo con las secuencias comparadas en el GenBank y número de acceso AB587010 se corroboró la identidad del hongo F. verticillioides, el cual se confirmó en 100 % de homología con las secuencias de F. verticillioides cepa CBS 576.78.

Efecto del biocontrol en la incidencia de pudrición de mazorca

El efecto del biocontrol evaluado a los 150 días después de la siembra, demostró que los tres métodos de aplicación (p ≤ 0.0002) y las tres especies de Trichoderma spp. (p ≤ 0.0001) redujeron significativamente la incidencia de pudrición de mazorca ocasionada por F. verticillioides. La incidencia de pudrición osciló de 47 a 79 % en los tratamientos, siendo TS+TA el más eficaz, incrementando la sanidad de planta en 53 % respecto al testigo que presentó la incidencia más alta (Figura 1). Resultados similares fueron reportados previamente por ^{Chandra et al. (2008)} quienes señalaron que con la aplicación de microorganismos antagónicos como T. harzianum, la incidencia fue disminuida en más del 50 %. Otro estudio realizado por ^{Ferrigo et al. (2014)} designaron que T. harzianum T22 redujo en 58 % la colonización de F. verticillioides mediante tratamiento de la semilla, lo cual hace promisorio el uso de Trichoderma para reducir el daño por F. verticillioides, tal como se observó en éste estudio.

Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes según la prueba de Tukey, probada con p = 0.05. Las barras son la desviación estándar de la media.

Figura 1 Efecto de Trichoderma spp. sobre la incidencia de la pudrición de la mazorca con tres tratamientos diferentes. 

La infección del maíz por F. verticillioides puede ocurrir a través de varias rutas, el método más comúnmente reportado para la infección del grano es a través de conidios en el aire que infectan los estigmas, después de la invasión de los estigmas el hongo infecta los granos (^{Sartori et al., 2015}). La infección sistémica puede comenzar con conidios o micelio del hongo que se transportan dentro de las semillas o en la superficie de éstas. El hongo se desarrolla dentro de la planta joven, pasando de las raíces al tallo y finalmente a la mazorca y los granos (^{Duncan & Howard, 2010}). Los resultados obtenidos en la presente investigación se hace evidente que al tratar las vías de entrada del hongo F. verticillioides con diferentes especies de Trichoderma en genotipos de maíz, se puede reducir la incidencia y la severidad de la enfermedad en diferentes niveles de biocontrol, encontrándose el mejor resultado con la inoculación de la semilla y aspersión foliar en combinación.

Por otra parte las tres cepas de Trichoderma redujeron significativamente la incidencia de pudrición de mazorca (p ≤0.0001) en diferentes niveles de biocontrol, sin embargo tal efecto fue significativamente notorio en la cepa de T. harzianum que presentó el nivel más bajo de incidencia respecto al testigo. Es importante mencionar que de las tres cepas, el hongo T. longibrachiatum fue el que presentó la incidencia más alta, seguida por T. asperellum y T. Harzianum tal como se muestra en la Figura 2, no se observó diferencia estadística entre T. asperellum y T. harzianum, sin embargo el efecto de biocontrol fue estadísticamente superior respecto al testigo. Éste efecto de biocontrol también fue documentado por ^{Cavaglieri et al. (2005)} debido a la aplicación de Bacillus subtilis en plantas de maíz en condiciones de invernadero donde se observó la reducción de colonización del rizoplano y la endorizosfera por parte de F. verticillioides.

Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes según la prueba de Tukey, probada con p = 0.05. Las barras son la desviación estándar de la media.

Figura. 2 Efecto de Trichoderma spp. sobre la incidencia de pudrición de la mazorca con tres cepas diferentes. 

El género Trichoderma comprende una gran cantidad de especies que actúan como agentes de control biológico, cuyas propiedades antagónicas se basan en la activación de múltiples mecanismos de acción (^{Mukherjee et al., 2014}). Para éste estudio, el biocontrol se pudo observar en las tres cepas de Trichodema con diferentes niveles de efectividad, posiblemente se debe a que las cepas ejercieron más de un mecanismo de acción para suprimir el crecimiento y desarrollo de F. verticillioides y así disminuir la incidencia y severidad de la enfermedad. Las especies de Trichoderma actúan contra los fitopatógenos fúngicos, ya sea indirectamente, compitiendo por nutrientes y espacio, modificando las condiciones ambientales, promoviendo el crecimiento vegetal o la defensa sistémica de las plantas y por medio de antibiosis, o directamente, por mecanismos como el micoparasitismo (^{Gwa & Nwankiti, 2017}).

Éstos mecanismos indirectos y directos pueden actuar de manera coordinada y su importancia en el proceso de biocontrol depende de la cepa de Trichoderma, el hongo antagonizado, la especie de planta y las condiciones ambientales, incluida la disponibilidad de nutrientes, pH, temperatura, entre otros (^{Filizola et al., 2019}). La activación de cada mecanismo implica la producción de compuestos y metabolitos específicos, como los factores de crecimiento de las plantas, enzimas hidrolíticas, sideróforos, antibióticos y nitrógeno (^{Rubio et al., 2014}). Los resultados que se presentan son estadísticamente superiores al testigo y se puede observar que las cepas de Trichoderma ejercieron diferentes niveles de control y que en cada técnica evaluada, las cepas pudieron haber coordinado mecanismos directos e indirectos como parte del biocontrol.

Efecto en la severidad de la enfermedad

Para la severidad se encontraron niveles relativamente bajos en los tres tratamientos, el TS + TA fue el que presentó la severidad más baja, en comparación con el resto de los tratamientos; los tres tratamientos se ubicaron en la clase dos de la escala de ^{Reid et al. (1996)} respecto al testigo el cual presentó niveles de daño de 10.89 % y se ubicó en la clase 3 de la misma escala con relación a la media ponderada. La prueba de Friedman confirmó que al menos dos tratamientos son diferentes al nivel de significancia de p = 0.05 mostrando diferencia significativa. La efectividad de los tratamientos se determinó mediante la fórmula de ^{Abbott (1925)} y se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 2), en todos los tratamientos se obtuvo arriba del 70 % de efectividad, además se pudo observar que en todos los tratamientos donde se aplicaron las cepas de Trichoderma la floración se adelantó al menos una semana respecto al testigo. En otros estudios realizados por ^{Chandra et al. (2009)} demostraron que el tratamiento de semillas y tratamiento por aspersión de un cultivo puro de Pseudomonas fluorescens redujo la incidencia de pudrición de mazorca en un 83 %, con formulaciones en polvo de talco, almidón de maíz y salvado de trigo redujeron la pudrición de mazorca en un 81, 79 y 77 %, respectivamente.