Introducción

Salmonella spp. es el agente causal de infecciones gastrointestinales conocidas como salmonelosis, enfermedad considerada como un problema de salud pública a nivel mundial (^{Kumar et al., 2019}). En México, durante el año 2018 se presentaron 124,277 casos de enfermedades ocasionadas por diferentes serotipos de Salmonella (^{SINAVE, 2018}), mientras que para el año 2019 hasta el mes de octubre, se presentaron 103,289 casos (^{SINAVE, 2019}). La principal ruta de transmisión para este patógeno es a través de la ingesta de agua y alimentos contaminados, como la carne y sus derivados, los cuales, si no cumplen con las normas de calidad e higiene pueden ocasionar importantes problemas a la salud humana (^{Fachmann et al., 2017}).

El consumo de carne bovina es de gran importancia, en México después de la carne de pollo, es la segunda variedad de carne más consumida (^{FIRA, 2017}). Para el cierre del año 2018, México ocupó el sexto lugar a nivel mundial en consumo de carne de bovino, lo que representó el 3.2 % del consumo mundial (^{USDA-FAS, 2018}; ^{SIAP, 2018}).

En México, la instancia responsable de establecer criterios e inspeccionar la calidad de los productos pecuarios de consumo humano es la Secretaría de Agricultura y Desarrollo Rural (SADER), que a través del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA), ha establecido una clasificación de los rastros que operan en las diferentes entidades del país. Dependiendo del cumplimiento de estándares internacionales de calidad e inocuidad de sus productos, SENASICA los ha denominado rastros Tipo Inspección Federal (TIF), los cuales aseguran el cumplimiento de la normativa de SENASICA y son constantemente monitoreados, mientras que los rastros “No-TIF” no son monitoreados, por lo que no aseguran el cumplimiento de dicha normativa (^{FIRCO, 2016}).

El objetivo de la presente investigación fue analizar y comparar la presencia de Salmonella spp. en carne de res de rastros “TIF” y “No-TIF” comercializada en supermercados de reconocido prestigio, así como carne “No-TIF” comercializada en carnicerías locales (carnes populares) de la Ciudad de Tepic, Nayarit México.

Material y Métodos

Se recolectaron muestras de carnes de bovino provenientes de rastros “TIF” (n=10) y muestras de carnes provenientes de rastros “No-TIF” (n=10) en diferentes supermercados de reconocido prestigio; además en carnicerías locales se colectaron muestras de carne (carnes populares) “No-TIF” (n=10). Todos los establecimientos estuvieron localizados en la ciudad de Tepic, Nayarit México. Las muestras fueron llevadas al laboratorio en condiciones asépticas (bolsas estériles y en cadena de frío) y procesadas inmediatamente.

Las muestras se procesaron de acuerdo con el flujo de trabajo de NF Validation^TM por Applied Biosystem^®. Para esto, 25 g de cada muestra se homogeneizó en 225 mL de caldo tetrationato (caldo TT) (BD Bioxon^®, México) en un homogeneizador stomacher (BagMixer^® 400W, France) a velocidad constante (8 golpeteos/s) durante 1 minuto y se incubaron durante 20 h a 37 ºC; posteriormente, las muestras enriquecidas se diluyeron con agua peptonada (15 g/L) (BD Bioxon^®, México) manteniendo una proporción de 1:9 y se incubaron durante 20 h a 37 ºC.

Para la extracción de DNA se siguieron las instrucciones de “PrepSEQ^® Rapid Spin Sample Preparation Kit”. Para esto, se colocaron 750 µL de cada dilución enriquecida en columnas de filtración y se centrifugaron a 12,000 xg durante 3 minutos, posteriormente se descartó el sobrenadante y se agregaron 50 µL de solución de lisis, se homogeneizaron los pellets previamente formados y se incubaron las muestras a 95 °C durante 12 minutos. Las muestras se llevaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 12,000 xg por 1 minuto. Por último, se agregaron 250 µL de agua libre de nucleasas a cada una de las muestras se homogeneizaron y se centrifugaron a 12,000 xg por 2 minutos. El sobrenadante conteniendo el DNA se utilizó para identificar a Salmonella spp. por la técnica de qPCR.

Para la detección de Salmonella spp. se siguieron las instrucciones de MicroSEQ^® Salmonella spp. Detection Kit. Se colocaron 30 µL de las muestras de DNA en cada tubo conteniendo perlas liofilizadas, posteriormente se mezclaron cuidadosamente y se prosiguió con la qPCR, utilizando el equipo 7500 Fast Real-Time PCR Instrument (Applied Biosystem^®). Para validar la reacción de qPCR, se contó con un control positivo interno (IPC), el cual fue analizado de forma paralela con cada una de las muestras. Como control negativo, se utilizó “Pathogen Detection Negative Control”. Mientras que como control positivo externo al kit, se utilizó un cultivo de Salmonella spp. con una densidad bacteriana de 0.5 en la escala de McFarland.

Los resultados fueron cualitativamente interpretados como: ausencia o presencia de Salmonella según el RapidFinder^™ Express Software utilizado. Mientras que los valores de Ct (ciclo umbral de amplificación) obtenidos fueron considerados como un valor semicuantitativo del grado de contaminación por Salmonella spp. en las muestras positivas.

Los datos cualitativos obtenidos, se analizaron a partir de sus frecuencias relativas, utilizando una prueba de chi-cuadrada, mientras que los datos semi-cuantitativos se analizaron aplicando la prueba de Kruskal-Wallis, sub-prueba de Dunn. Se utilizó el software GraphPad Prim Version 6.0 (GraphPAd Software, Inc. USA). Se consideró una significancia estadística con un valor de p < 0.05.

Resultados y Discusión

Al realizar el análisis comparativo, se observó que no existe diferencia estadísticamente significativa (p > 0.05) en la presencia de Salmonella spp. entre la proporción de muestras “TIF” y “No-TIF” (5/10 vs 7/10) obtenidas en supermercados; no obstante, la presencia de Salmonella spp. fue detectada en el 100 % de las muestras adquiridas en carnicerías locales (Figura 1).

Figura 1 Frecuencia de muestras con presencia de Salmonella spp. en carnes TIF y carnes No-TIF comercializadas en la Ciudad de Tepic Nayarit, México. Los valores de frecuencia fueron comparados a través de la prueba de Chi-cuadrada. Letras diferentes en cada grupo, indican diferencia estadísticamente significativa p < 0.05. 

La no diferencia significativa entre la carne “TIF” y “No-TIF”, sugiere que los puntos críticos de control y prevención de la contaminación que se contemplan en los supermercados son importantes para disminuir riesgos relacionados con la inocuidad. De esta manera, si bien en los rastros “TIF” se vigilan procesos que incluyen, entre otros, el confort animal, métodos de sacrificio del animal y almacenamiento de la carne (^{FIRCO, 2017}), el hecho de que la carne “No-TIF” que se distribuye a través de supermercados tenga una proporción de contaminación similar a la carne “TIF”, indica que la manipulación en los puntos de distribución final es muy importante. Lo que contrasta con la alta contaminación detectada en la carne proveniente de carnicerías locales (carnes populares), establecimientos que no suelen contar con un programa de prácticas de higiene para el proceso de alimentos, como es el control de la temperatura y otras medidas básicas de inocuidad del producto (control de roedores y otros vectores).

Por otra parte, un parámetro que se consideró importante en esta investigación, fue el valor del ciclo umbral de amplificación (Ct), ya que éste es inversamente proporcional a la concentración de DNA del patógeno y por lo tanto puede tomarse como una medida indirecta del grado de contaminación de la carne. En este sentido, la distribución de los datos obtenidos para la carne “TIF” estuvieron muy cercanos al valor límite de Ct establecido para muestras negativas (Ct > 35), incluso 5 de estas muestras presentaron valores de Ct por arriba de este valor (por lo que se consideraron muestras negativas), las 5 muestras restantes de carne TIF, fueron positivas a la presencia de Salmonella spp., pero sólo 1 de las muestras presentó un valor de Ct de 21.90, las 4 restantes presentaron valores de Ct apenas por debajo de 35 (Figura 2), por lo que se considera que el grado de contaminación por Salmonella spp. en este tipo de carne es bajo; incluso es probable que, por técnicas menos sensibles, estas muestras pudieran considerarse como negativas (falsos negativos).

Figura 2 Distribución de valores de Ct obtenidos en carnes TIF y “No TIF” para la determinación de Salmonella spp. En cada grupo (n=10) se muestra el valor de la mediana. El valor de Ct es inversamente proporcional a la cantidad de DNA de Salmonella encontrado en las muestras. Los datos fueron comparados a través de una prueba de Kruskal-Wallis, sub-prueba de Dunn. 

Por otra parte, para la carne “No-TIF” distribuida en supermercados, el valor de la mediana fue de 27.03 y sólo 3 muestras estuvieron por arriba del punto de corte (muestras negativas); mientras que, en la carne proveniente de comercios locales, las 10 muestras estuvieron por debajo del punto de corte (100 % de las muestras fueron positivas a la presencia de Salmonella spp.), siendo el valor de la mediana de 21.69 (Figura 2).

En un estudio realizado por ^{Narváez-Bravo et al. (2013)}, se reportó una prevalencia de S. enterica en carne pre-desviscerada de 49.2 %, mientras que en sólo 6 % de la carne al final del proceso se detectó este microorganismo. Lo anterior resalta la importancia de las medidas sanitarias que se tengan implementadas en el rastro. Por otra parte, ^{Pérez-Montaño (2012)}, analizó 505 muestras de canales de bovinos y reportó una prevalencia de 15.5 % de Salmonella spp. De éstas, los serotipos de mayor prevalencia fueron S. Give y S. Typhimurium, con 24.4 % y 17.9 % de detección, respectivamente. Por otra parte, ^{Hernández-San Juan (2007)}, reportó una prevalencia de S. enterica de 13.8 % en canales de res. En los tres estudios previamente mencionados se demuestra que la carne de res que se comercializa en México frecuentemente presenta contaminación por Salmonella, traspasando la reglamentación establecida por SENASICA.

En México, la entidad gubernamental que es responsable del monitoreo de Salmonella spp. en los puntos de venta al público de la carne es la COFEPRIS. Esta entidad establece en su normatividad que los productos cárnicos listos para venta al público deben ser negativos a la presencia de Salmonella (^{NOM-213-SSA1-2002}; ^{NOM-114-SSA1-1994}). Sin embargo, bajo las condiciones socio-económicas y culturales de México, estas normativas son difíciles de cumplir. En un estudio publicado por ^{Parrilla et al. (2014)}, en productos derivados de carne la prevalencia de muestras positivas para Salmonella, fue desde 2.5 %, hasta productos con una prevalencia de contaminación de 36 %; Los serotipos de S. enterica más comunes fueron: Derby (29.6 %), London (16.8 %), Give (7.3 %), Anatum (7.0 %), Agona (6.7 %) e Infanti (5.1 %).

Por otra parte, diversos grupos de investigación han realizado monitoreos microbiológicos en carne de res que se comercializa en varios estados de México, como: Tabasco, Ciudad de México, Hidalgo, Jalisco y Nuevo León, en todos los casos se reportaron muestras positivas a Salmonella spp, con valores de 1.2 % - 30 % de muestras positivas (^{Esquivel-Hernández & Nava-Morales, 2017}).

Además de los potenciales riesgos a la salud que representa la contaminación de la carne, existe el problema de la falta de consenso internacional sobre métodos de detección de este microorganismo. En este contexto, en México, para determinaciones de rutina aún se siguen utilizando métodos manuales o automatizados de microbiología (basados en pruebas de perfil bioquímico). No obstante, los métodos moleculares, basados en identificación de fragmentos génicos han demostrado mayor sensibilidad y especificidad. Tal como lo demuestra un estudio publicado por ^{Yañez et al. (2008)}, en el cual reportan hasta 20 % de diferencia en los límites de detección entre el método de qPCR vs método convencional, además que con el método molecular se obtuvieron resultados en 24 h, mientras que, con el método convencional, los resultados se obtuvieron en 4 días. Por otra parte, las estrategias moleculares permiten desarrollar métodos basados en PCR multiplex, los cuales permiten detectar y cuantificar varios patógenos simultáneamente y de una manera mucho más rápida (^{García-López et al., 2009}).

De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, el grado de contaminación por Salmonella spp. en la carne “TIF”, resultó ser menor (tanto en número de muestras, como en valor de Ct) en comparación con los otros dos grupos. Resulta alarmante que el 50 % de las muestras TIF resultaron contaminadas con Salmonella, lo cual indica que el consumir carne “TIF” no es sinónimo de seguridad e inocuidad del producto; sin embargo, esta investigación no permite identificar si la contaminación por Salmonella spp. de este tipo de carne se genera en el rastro “TIF” o bien durante la manipulación final del producto.

Conclusion

A partir de los resultados del presente trabajo de investigación, se puede concluir que se identificó la presencia de Salmonella spp. en los tres grupos de carne analizadas, sin embargo, las carnes TIF fueron las que presentaron menor contaminación con esta bacteria potencialmente patógena para el humano.