Reactivos

AAPH (2-2´- Azobis (2-methylpropionamidine dihydrochloride), DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazilo), ABTS (2,2′- azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico) y DMSO (Dimetil sulfóxido), fueron obtenidos de Sigma Aldrich, Co. (St. Louis Missouri, USA). El agar Mueller-Hinton, y todos los demás reactivos y solventes no especificados fueron comprados en J.T Baker (BakerMallinckrod, México).

Preparación de los extractos

Las ramas de barchata (Ziziphus obstusifolia) fueron obtenidas del sur de Sonora, México, durante el periodo Mayo-Diciembre 2016, y se identificaron por el herbario de la Universidad de Sonora (Espécimen No.20395).

Para la preparación del extracto EtOH-ac se utilizó el método descrito por ^{Silva et al., 2014}. Las ramas de barchata (Ziziphus obstusifolia) se secaron al sol y pulverizaron con un molino industrial. Se tomaron 10 g del polvo de barchata y fueron añadidos a 150 mL de una solución extractora (EtOH-Ac) que consistía en la mezcla de etanol y ácido acético (95:5 % v/v), y se mantuvo en la oscuridad durante 48 horas en maceración con agitación intermitente. Después de 12 h, la solución se filtró a través de papel filtro Whatman No. 1 y el extracto se concentró en rotavapor (Yamato RE301-Japón) y se disolvió en sulfóxido (DMSO) al 5 % para su fácil manejo.

Para producir las infusiones acuosas (Ac), se colocó 1 g del polvo de ramas de barchata en 100 mL de agua y se hirvió por 3 minutos. El extracto EtOH-Ac se filtró y concentró en rotovapor, para su evaluación se disolvió en agua.

Inhibición del radical DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazilo)

Se midió la capacidad antioxidante de los extractos mediante la inhibición del radical DPPH según ^{Moein & Moein (2010)} con algunas modificaciones. Una alícuota de 280 µL de la solución del radical DPPH (0.025 mg/mL en metanol) se mezcló con 20 µL del extracto, la reacción se dejó reposar por 30 min en completa oscuridad y se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm en un espectrofotómetro Fluostar Omega spectrophotometer (BMG Labtech, Chicago, IL, USA). La actividad antioxidante se calculó usando una curva de calibración de trolox y los resultados se expresaron como mmol equivalente trolox/g de extracto (mmol ET/ge).

Inhibición del radical ABTS (2,2′- azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico)

Se determinó de acuerdo a la técnica descrita por ^{Re et al. (1999)}. El radical ABTS se preparó por dilución (19 mg/5 mL de agua destilada) y una solución de persulfato de potasio (37.8 mg/mL de agua destilada). Se tomaron 88 µL del radical ABTS preparado y fueron añadidos a la solución de persulfato de potasio. Dicha mezcla se dejó reposar por 12-16 h a temperatura ambiente. De esta solución se tomaron 500 µL y se diluyeron en 30 mL de etanol para ajustar la absorbancia a 0.7 ± 0.02 unidades en un lector de microplacas a una longitud de onda de 750 nm. Finalmente, se colocaron 295 µL del radical y 5 µL del extracto y se realizaron las medición inicial (Absi) y después de 7 min (Absf). La actividad antioxidante se calculó usando una curva de calibración de trolox y los resultados se expresaron como mmol equivalente trolox/g de extracto (mmol ET/ge).

Efecto protector sobre eritrocitos humanos

La hemólisis fue inducida por el radical AAPH (2-2´-Azobis (2-methylpropionamidine dihydrochloride) de acuerdo a la metodología de Luy et al. (2010). Los eritrocitos humanos fueron lavados en 3 tiempos con buffer salino PBS (37mM de NaCl, 2,7 mM de KCI, 8 mM de Na₂HPO₄ y 2 mM de KH₂PO₄ P/V) a pH de 7.4. Una vez lavados, se preparó una suspensión de eritrocitos al 5% en PBS. Para el ensayo, se mezclaron 50 µL de la suspensión de eritrocitos, 50 µL del extracto y 200 µL del radical AAPH, y la mezcla se incubó a 37 °C en baño maría con agitación (30 rpm) durante 3 h. Una mezcla de reacción similar se preparó sin extracto como control (hemólisis completa). Terminada la incubación, se agregó 1 mL de PBS y se centrifugó a 3500 rpm por 10 min y se midió la absorbancia del sobrenadante en un lector de microplacas a 540 nm. El resultado se expresó en porcentaje de inhibición, la cual se calculó mediante la siguiente fórmula: (Abs. Control- Abs. Final)/Abs. Control * 100).

Propagación del bacteriófago

El bacteriófago Av08 se obtuvo del Laboratorio Nacional de Investigación en Seguridad Alimentaria del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD) en Culiacán, Sinaloa, México. Para la propagación del bacteriófago Av08, se utilizó el método de la doble capa de agar, descrito por ^{Jamalludeen et al. (2009)}. Brevemente, se mezclaron 100 μL del bacteriófago con 1 mL de la bacteria hospedera (E. coli O157) en un tubo que contenía 3 mL de TSB por sus siglas en inglés (Caldo de Soya Tripticaseína) con agarosa 0.4 % a 45-48°C. La mezcla se agitó suavemente y se vertió sobre cajas Petri con medio TSA (Agar de Soya Tripticaseína); una vez solidificada la capa suave, las cajas se incubaron durante 18-24 horas a 37°C.

Después de la incubación, a cada caja se le añadieron 6 mL de buffer SM (MgSO₄.7H₂O 8 mM, NaCl 100mM, gelatina de piel de porcino tipo A al 0.002 % P/V) y se agitó por oscilación durante 3 horas. El buffer y la capa suave se recuperaron por remoción con un asa bacteriológica y se vació en un tubo de 50 mL, enseguida se centrifugó a 10,000 x g durante 15 minutos a 4°C para eliminar los detritus de la bacteria y la fase sólida del TSB-agarosa.

El sobrenadante se recuperó y se filtró a través de una membrana de nitrocelulosa (Whatman, USA) con tamaño de poro 0.45 μm para su cuantificación y posterior uso.

Cuantificación del bacteriófago

Se prepararon diluciones decimales del bacteriófago Av08 en buffer SM. Se tomaron 50 µL de cada una de las diluciones del fago, 500 µL de la bacteria E. coli O157 y se colocaron en tubos que contenían 1.5 mL de TSB-agarosa 0.4 %. La mezcla se vertió en cajas Petri con TSA correspondientes a cada dilución y se dejaron solidificar. Las cajas se incubaron a 37°C durante 24 horas y transcurrido el tiempo se procedió a leer las placas, contando las Unidades Formadoras de Placa (PFU/mL) de cada caja y la concentración del bacteriófago se calculó con la siguiente fórmula: PFU/mL = No. de placas [PFU]/ (Factor de dilución)(volumen inoculado [mL]).

Ensayo antiviral

Se midió el efecto antiviral de los extractos EtOH-ac y Ac contra el bacteriófago Av08 cuyo material genético es dsDNA. Los extractos se disolvieron en 5 % de DMSO y se esterilizaron a través de un filtro de membrana de 0.45 µm. Las concentraciones ensayadas fueron 5 y 10 mg/mL. Una alícuota de 100 µL del fago (1 X10⁹ PFU/mL) se confrontó con 3 mL del extracto. Se evaluaron 3 tiempos de contacto: 0, 30 y 60 min. Al finalizar cada tiempo, la reacción se detuvo añadiendo una solución neutralizante de lecitina de soya, de acuerdo con la ^{SCFI (1999)}. A continuación, se prepararon diluciones decimales en buffer SM (10^-2, 10^-4, 10^-6, 10^-8, 10^-10 y 10^-12) y empleando la técnica de la doble capa de agar se cuantificó al fago. La reducción viral se expresó como Log₁₀ PFU/mL.

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento

Los microorganismos se obtuvieron del laboratorio de Inocuidad Alimentaria del Centro de Investigación e Innovación en Biotecnología, Agropecuaria y Ambiental (CIIBA) del Instituto Tecnológico de Sonora (ITSON). Las bacterias Staphylococcus aureus (ATCC 65384) y Escherichia coli O157 (ATCC 43890) se mantuvieron en caldo de soya y tripticaseína (TSB) con glicerol (20 %) a -40ºC hasta su uso. Con un asa bacteriológica se transfirió una alícuota de cada bacteria a tubos conteniendo 10 mL de TSB y se incubaron a 37 ºC por 24 h para su uso en los ensayos de inhibición.

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana

La actividad antimicrobiana se evaluó mediante el método de difusión en disco, empleando la técnica descrita por ^{Andrews (2001)}. Placas Petri con agar Müeller Hinton se inocularon con 100 µL de la suspensión bacteriana (1 X 10⁸ PFU/mL), la cual se distribuyó de manera homogénea con perlas de vidrio estériles. Por separado, se colocaron 40 µL del extracto correspondiente (EtOH y Ac) en discos estériles de papel filtro (5 mm de diámetro, Whatman N º1) y éstos fueron colocados sobre las placas inoculadas con cada bacteria. Las placas fueron incubadas a 37°C por 24 horas para su posterior medición de los halos de inhibición. Se incluyeron tratamientos de testigos negativos, que consistieron en discos impregnados con DMSO (5 %).

Análisis Estadístico

La evaluación de la actividad antioxidante medida por la inhibición de los radicales (DPPH, ABTS y AAPH), además de la antimicrobiana se realizó a través de un análisis de varianza (ANOVA) de una sola vía con experimentos independientes y totalmente al azar con tres repeticiones, considerando el factor “extracto” con dos niveles (EtOH-ac y Ac).

En el análisis estadístico de los datos de actividad antiviral contra el fago Av08, se utilizó un diseño de tres factores totalmente al azar. Los factores fueron “extracto” con dos niveles (EtOH-ac y Ac); “concentración” con dos niveles (5 y 10 mg/mL), y “tiempo de contacto” con tres niveles (0, 30 y 60 min). Todos los experimentos se realizaron por duplicado con dos repeticiones cada uno. Todos los datos fueron analizados con el paquete estadístico Statgraphics versión 15 mediante ANOVA y α=0.05.

Capacidad antioxidante de los extractos mediante el radical DPPH

En este estudio se evaluó la capacidad de los extractos EtOH-ac y Ac de barchata para inhibir el radical DPPH. En la Figura 1 se muestra la inhibición del radical. Se pueden observar valores de inhibición de 25.03 ± 3.73 mmol ET/ge y 23.06 ± 0.24 mmol ET/ge para los extractos Ac y EtOH-ac, respectivamente. Los resultados muestran que la capacidad antioxidante de los extractos varía de acuerdo a la naturaleza química de los mismos y a los solventes empleados en la extracción de sustancias con actividad biológica.

Figura 1 Capacidad antioxidante por medio del ensayo DPPH de extractos Ac y EtOH-ac de barchata (Ziziphus obtusifolia). Los valores son la media ± desviación estándar (n=3). ET, Equivalente Trolox (homólogo de la vitamina C) ge, gramo de extracto. 

Los resultados obtenidos en este estudio concuerdan con lo descrito por ^{Kang et al. (2003)}, quienes realizaron ensayos de capacidad antioxidante de extractos naturales con diferentes solventes tanto polares como no polares, y concluyeron que la capacidad antioxidante se ve influenciada por la polaridad del solvente utilizado.

Durante el presente estudio, no se encontraron investigaciones que documenten las propiedades antioxidantes de Ziziphus obtusifolia medidas por inhibición de radicales sintéticos como DPPH. Sin embargo, ^{Dias et al. (2013)}, observaron que extractos etanólicos de especies de Ziziphus poseen agliconas que presentan capacidades de reducción de radicales libres hasta en un 25 %, y reportaron que los extractos que presentan alta concentración de saponinas glucosiladas reducen su actividad antioxidante. Así mismo, ^{Navas & Carrasquero (2012)}, estudiaron la actividad antioxidante que proporcionaban los extractos etéreos de Ziziphus mauritiana en el aceite refinado de soya a altas temperaturas, observando una alta protección al aceite por dicho extracto, y atribuyeron la actividad a la presencia de biofenoles, flavonoides y taninos.

Capacidad antioxidante de los extractos mediante el radical ABTS

En este estudio también se midió la capacidad de los extractos para inhibir el radical catiónico ABTS (2,2’-azinobis- [3-etil benzotiazolin-6-sulfonato de amonio]). La Figura 2 muestra la capacidad antioxidante para los extractos mediante la reducción de este radical, donde se obtuvieron valores de 17.41 ± 0.01 mmol ET/ge y 23.35 ± 0.02 mmol ET/ge para los extractos Ac y EtOH-ac, respectivamente. Asimismo, se observa que los extractos etanólicos acidificados mostraron mayor capacidad para inhibir este radical. ^{Dorta et al. (2013)} han observado que los sistemas ácidos son más efectivos en la recuperación de compuestos bioactivos, y que posiblemente podrían favorecer la biodiponibilidad e hidrólisis de compuestos N-glucosilados. La barchata contiene compuestos nitrogenados tales como el ácido glutámico y ácido aspártico (^{Moran et al., 2014}), y de acuerdo con ^{Wu (2009)} estas sustancias activas presentan actividad antioxidante.

Figura 2 Capacidad antioxidante por medio del ensayo ABTS de extractos Ac y EtOH-ac de barchata (Ziziphus obtusifolia). Los valores son la media ± desviación estándar (n=3). ET en Equivalente Trolox (homólogo de la vitamina C) ge, gramo de extracto. 

Capacidad antioxidante mediante la prueba de hemólisis con el radical AAPH

La Figura 3 muestra la capacidad protectora de los extractos Ac y EtOH-ac sobre ertirocitos humanos, utilizando al radical AAPH. La gráfica indica los porcentajes de inhibición de hemólisis, los cuales fueron de 46.3 % y 36.8 % para los extractos Ac y EtOH-ac, respectivamente.

Figura 3 Capacidad antioxidante por medio del ensayo de % de inhibición de hemolisis inducida mediante AAPH de extractos acuosos y etanólicos acidificados de barchata (Ziziphus obtusifolia). 

Recientemente se han estado utilizando medios biológicos como eritrocitos humanos, con la finalidad de determinar la capacidad antioxidante de diversas sustancias bioactivas sobre la peroxidación lipídica de las células (^{Quihui et al., 2017}). Este método está basado en la inducción de hemólisis generada por el radical AAPH (2,2’-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride). Este radical provoca la liberación del hierro desde la hemoglobina, actuando como pro-oxidante. La liberación del hierro desde los hematíes puede aumentar el efecto pro-oxidante de hidroperóxidos provenientes de la reacción del oxígeno y el AAPH (^{Veiga et al., 1997}).

No se encontraron estudios donde se haya evaluado la capacidad de los extractos de barchata para proteger a los eritrocitos humanos utilizando el radical AAPH. Asimismo, no se encontraron antecedentes del género Ziziphus donde se haya evaluado esta misma propiedad. Para fines de esta investigación se compararon los resultados con trabajos semejantes.

^{Magalhães et al. (2009)}, analizaron el porcentaje de inhibición de hemólisis de extractos metanólicos de la cáscara y pulpa de membrillo y reportaron valores de 70 y 75 %, respectivamente. Por otro lado, se ha demostrado que compuestos como el ácido gálico, elágico, clorogénico, quercetina, catequina, rutina, carotenoides, entre algunos otros, poseen un efecto protector contra la hemólisis inducida en eritrocitos humanos de hasta el 99 % (^{Chirinos et al., 2008}; ^{Hapner et al., 2010}). Se ha reportado que extractos de hojas de la planta Toona Sinensis presentan valores de inhibición del 75 al 85 % (^{Hseu et al., 2008}).

En general, se observa que los diversos reportes muestran valores en el orden del 30 % al 40 % superior a los encontrados en nuestro estudio. Esta divergencia se puede explicar en base de la diversidad de técnicas utilizadas para obtener los extractos, o bien, a la composición de los mismos. Previos reportes muestran que especies de Zizhipus contienen saponinas (Ribeiro et al., 2013), la cuales son capaces de causar hemólisis en los eritrocitos (^{Martínez, 1995}). Por lo que se podría suponer cierta citotoxicidad.

Estudios realizados por ^{Molina-Romo et al. (2018)} argumentaron que Ziziphus obstusifolia tiene efecto antiproliferativo, por lo que no se pueden descartar completamente sus potencialidades contra células tumorales o cancerígenas.

Capacidad antibacteriana

En la Tabla 1 se muestra la actividad antibacteriana presente en los extractos EtOH-ac y Ac, medida por halos de inhibición. Los valores que arrojaron para las concentraciones 5 y 10 mg/mL respectivamente fueron los siguientes. Para la bacteria E. coli O157 en el extracto EtOH-ac mostró valores de 7.83 a 10.16 mm de diámetro, mientras que en el extracto Ac los valores de inhibición fueron de 7.83 a 8.00 mm. Para la bacteria Staphylococcus aureus el extracto EtOH-ac mostró resultados de 8.00 a 9.00 mm de diámetro y en el extracto Ac se obtuvo una inhibición de 8.00 a 9.06 mm.

En un estudio similar de extractos de Zanthoxylum se mencionan los halos de inhibición obtenidos de algunos antibióticos como tetraciclina con 9.00 mm para S. aureus y 10.00 mm para E. coli; antraciclina con 12.00 mm para S. aureus y 10.00 mm para E. coli; y kanamicina con 9.00 mm para S. aureus y E. coli (^{Patiño et al., 2011}). En general los resultados obtenidos de los dos tipos de extractos fueron muy similares a los antibióticos por lo que podrían ser considerados como buenos agentes antibacterianos contra las bacterias estudiadas, además estos resultados son promisorios para continuar con estudios antimicrobianos mas específicos.

Por otro lado, también se observa que al aumentar la concentración del extracto, la actividad inhibitoria contra las cepas evaluadas también incrementó. Lo cual nos indica que la actividad antibacteriana de los extractos es dependiente de la concentración.

La barchata contiene sustancias bioactivas tales como los aminoacidos valina o leucina (^{Moran et al., 2014}). A estos compuestos se les clasifica como bacteriocinas, los cuales son efectivos contra microorganismos patógenos importantes como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Salmonella spp. (^{Beristain et al., 2012}), por lo que es posible que estas sustancias pudieran estar contribuyendo en la inhibición de las bacterias patógenas que se utilizaron en este estudio.

Por otro lado, en uno de los estudios realizados sobre especies a la que pertenece esta planta, se detectaron ciertas sustancias como taninos, saponinas, resinas, polifenoles y glucósidos cardíacos (^{Abalaka, 2010}). Así mismo, se ha informado que estos compuestos tienen actividad antimicrobiana (^{Moran et al., 2014}), lo que nos permite suponer también que estas sustancias contribuyen en la inhibición de los microorganismos utilizados en este estudio, los cuales son organismos patógenos de interés en la salud pública. Además, es conocido que en los países en desarrollo, donde la medicina tiene alto valor en la economía, la investigación de las actividades antibacterianas de plantas etnomedicinales siguen siendo una necesidad para atacar microorganismos patógenos, lo cual representa un área de oportunidad para tratar padecimientos originados por estos organismos.

Capacidad antiviral

Los extractos Ac y EtOH-ac fueron aplicados al bacteriófago Av08 para determinar la tasa de supervivencia del virus y la dosis efectiva en el tiempo requerido y así observar la reducción del virus causado por el efecto de los extractos.

Las reducciones logarítmicas se pueden observar en la Figura 4 para los extractos EtOH-ac y Figura 5 para los extractos Ac, los cuales muestran la reducciones del virus expresadas en Log₁₀ PFU/mL para tres tiempos de contacto: 0, 30 y 60 minutos, utilizando dos concentraciones de 5 y 10 mg/mL. Así mismo, se puede observar que en ambos extractos en el tiempo 0 minutos, no hubo una reducción significativa en comparación con el valor del control (p <0,05), sin embargo, a los 30 minutos de tiempo de contacto se observa una reducción significativa.

Figura 4 Actividad antiviral de los extractos EtOH-ac de Ziziphus obtusifolia medida por la reducción en Log10 UFP/mL para los tiempos de contacto 0, 30 y 60 minutos a dos concentraciones 5 mg/mL y 10 mg/mL. 

Figura 5 Actividad antiviral de los extractos acuosos de Ziziphus obtusifolia medida por la reducción en Log10 UFP/mL para los tiempos de contacto 0, 30 y 60 minutos a dos concentraciones 5 mg/mL y 10 mg/mL. 

Por otro lado, en el extracto EtOH-ac en los primeros 30 minutos de contacto del fago Av08, mostró reducciones de 1.5- 1.8 Log₁₀ PFU/mL, para las concentraciones 5 y 10 mg/ mL respectivamente. En los tiempos máximos de contacto del extracto con el fago, se observó una reducción de 4.30 Log₁₀ PFU/mL al tiempo de contacto de 60 minutos para la concentración de 5 mg/mL, y en la concentración 10 mg/mL al mismo tiempo mostró una reducción de 4.82 Log₁₀ PFU/mL (Figura 4).

Para el extracto Ac en ambas concentraciones 5 y 10 mg/mL durante los primeros 30 minutos no mostraron reducciones significativas, arrojando valores de reducción por el orden de 0.70 Log₁₀ PFU/mL, y fue hasta los 60 minutos que disminuyó 1.50 logaritmos en 5 mg/mL. Sin embargo, la reducción más alta mostrada fue a los 10 mg/ mL, disminuyendo hasta 2 logaritmos, posiblemente se debió al agotamiento y reducción de la biodisponibilidad de los metabolitos activos o compuestos después de 30 min del tiempo de contacto con los extractos.

El bacteriófago ADN Av08, utilizado en este estudio fue previamente aislado de las heces de aves de corral. Algunos estudios han demostrado que los bacteriófagos aislados de aves de corral son parte de la microbiota del medio ambiente, lo que demuestra la ocurrencia natural de fagos en el tracto intestinal. Así mismo, con ello se justifica su uso como modelo enteroviral (^{López et al., 2012}).

No existen estudios específicos en Ziziphus oftusifolia que demuestren que componentes son responsables de las actividades biológicas en enterovirus; Sin embargo, en un estudio de determinación de aminoácidos, se encontró que barchata contiene alanina, valina y leucina (^{Moran et al., 2014}) los cuáles son sustancias que se le atribuye capacidad antimicrobiana propias de algunas plantas (^{Beristain et al., 2012}). Otro estudio realizado por, ^{Eun-Hye et al., en el 2015}, encontraron que los ácidos betulínicos derivados de Ziziphus jujuba mostraron actividad antiviral contra el virus de la influenza A/PR/8 inducido en ratones. Además, en un estudio donde se evaluó la actividad antiviral de plantas medicinales frente al virus del Hepatitis B (VHB) en líneas celulares se encontró que extractos de Eucalyptus spp. mostraron la mayor actividad antiviral de las plantas estudiadas, donde se observó que los compuestos fenólicos son los responsable de dicha actividad inhibitoria y en Zizhipus ya se ha documentado la presencia de sustancias fenólicas (^{Gonzalez et al., 2006}). Por lo que no se descarta la actividad de estos compuestos como antiviral.