Área de estudio y recolecta de material biológico

Se realizaron muestreos en un total de 10 huertos comerciales ubicados en los municipios de Compostela y San Blas, Nayarit (Tabla 1), de los cuales, se visitaron dos veces a huertos diferentes mensualmente durante el periodo de enero a noviembre de 2017, donde se recolectaron frutos de guanábana con diferente grado de madurez fisiológica que presentaban síntomas de pudrición seca (96 frutos) y pudrición blanda de fruto (23 frutos). Los frutos enfermos se colocaron de manera individual en bolsas de papel y se trasladaron a temperatura ambiente al Laboratorio de Parasitología Agrícola del Centro Multidisciplinario de Investigación Científica (CEMIC 03) de la Universidad Autónoma de Nayarit (UAN) en donde se almacenaron a 0 °C hasta su procesamiento.

Aislamiento y purificación de microorganismos asociados a las pudriciones en frutos

Los frutos con síntomas de pudrición seca y pudrición blanda de fruto, se lavaron previamente con agua corriente; posteriormente se cortaron trozos de 5 a 10 mm² de la zona de transición (margen de la lesión de avance de la enfermedad) y se desinfectaron con una solución de NaClO al 2 % por tres minutos; en una campana de flujo laminar (TELSTAR AH-100), los trozos obtenidos fueron lavados tres veces con agua destilada estéril (ADE) y se secaron a temperatura ambiente sobre papel absorbente, y se sembraron cuatro en cada caja de Petri (90 x 15 mm) con medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) de forma equidistante, mismas que se mantuvieron en incubación en una cámara NOVATECH Ei45 a 28 °C para la obtención de los hongos fitopatógenos (^{Villanueva et al., 2008}).

Los hongos que crecieron a los siete días en el medio de cultivo, fueron transferidos a una caja nueva de Petri con PDA con el fin de purificar los aislamientos y se incubaron a 22 ± 4 °C, hasta su esporulación y se obtuvieron los cultivos monospóricos (^{Guigón & González, 2004}).

Identificación morfológica de microorganismos

Para la identificación morfológica, se tomó una muestra de micelio de 7 días de edad con ayuda de agujas de disección estériles y se realizaron montajes en portaobjetos con lactofenol claro y se cubrieron con cubreobjetos para su identificación morfológica a nivel de género con ayuda de un microscopio compuesto Leica® (modelo DME 13595XXX) y con las claves taxonómicasdicotómicas de ^{Barnett & Hunter (1998)} y ^{Watanabe (2002)}.

Pruebas de patogenicidad y grados de virulencia

De cada género de hongo aislado se obtuvo una suspensión de conidios, a los cuales, se les agregó a la caja de Petri 10 ml de ADE y 5 µl de Tween 80, se procedió a raspar el micelio con ayuda de un asa estéril y la suspensión obtenida se filtró con ayuda de una gasa estéril. El conteo de conidios se realizó con ayuda de una cámara de recuento Neubauer-improved (MARIENFELD®) y un microscopio compuesto (^{Ruiz et al., 2011}). Posteriormente se inocularon frutos de guanábana aparentemente sanos con el fin de reproducir el síntoma del que fue aislado y descubrir el agente causal de la pudrición. Para ello, se recolectaron frutos con apariencia sana de guanábana de tamaño de 6.21 cm de diámetro por 8.25 cm de longitud hasta un tamaño alrededor de 20 cm de longitud y 15 cm de diámetro para las pudriciones secas, en el caso de las pudriciones blandas se recolectaron frutos sanos de 6.5 cm de diámetro y 10 cm de longitud. El material biológico se colocó en una hielera envuelto con plástico protector y se trasladó al Laboratorio de Parasitología Agrícola. Los frutos se lavaron con agua corriente dentro de una hielera, posteriormente se desinfectaron por inmersión en una solución de NaClO al 2 % durante dos minutos (^{Gutiérrez et al., 2002}), la humedad sobre los frutos fue absorbida con sanitas estériles.

En la campana de flujo laminar los frutos de guanábana fueron inoculados sin herida (seis repeticiones y seis testigos) y con una herida superficial (seis repeticiones y seis testigos) en la epidermis de aproximadamente 15 mm de longitud y 5 mm de profundidad, la cual se realizó con ayuda de un bisturí estéril, y con la ayuda de una micropipeta Finnpipette® se les agregó 10 µl de la suspensión de conidios de acuerdo con la esporulación de cada aislado, se usaron concentraciones de cada uno de los géneros en un rango de los 11,200 conidios/ mL a 1,000,000 conidios/mL. En el caso de los hongos aislados de pudrición blanda, la inoculación se realizó con una suspensión de 0.5 cc con 11,200 conidios/mL con ayuda de una jeringa hipodérmica que se infiltró en el receptáculo floral a una distancia de 1 cm del pedúnculo (siete repeticiones y 7 testigos). Primero se inocularon los testigos con agua destilada estéril y posteriormente se inocularon los hongos aislados de cada síntoma para evitar contaminación cruzada. Los frutos inoculados se incubaron en una cámara bioclimática (Thermo Scientific) a 28 °C y un fotoperiodo 12:12 luz/oscuridad, se revisaron sistemáticamente cada 24 h por 10 d para registrar la sintomatología y medir el grado de avance de la pudrición (virulencia) con ayuda de un vernier digital (Truper Herramientas S.A de C.V). Para confirmar la identidad del microorganismo inoculado, se realizó un re-aislamiento y se verificó que coincidiera con el que se inoculó (^{Dinh et al., 2003}; ^{Fraire et al., 2003}; ^{Muñoz et al., 2003}; ^{Than et al., 2008}).

Identificación molecular de hongos causantes de las pudriciones de fruto de guanábana

Para la identificación molecular de los hongos positivos a las pruebas de patogenicidad, se extrajo el DNA genómico (gADN), para lo anterior, se colocó un explante del hongo purificado en cajas de Petri con medio PDA y se incubó a 28 °C por 7 d. Con la ayuda de una espátula estéril se recolectó el micelio, el cual se colocó en un mortero de porcelana estéril con un amortiguador [200 nM Tris-HCl (pH=8), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5 % SDS] a 70 °C (^{Ruiz et al., 2017}), se maceró y la extracción se realizó de acuerdo con ^{Raeder & Broda (1985)}. El gADN fue visualizado por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y se utilizó para amplificar el espaciador transcrito interno (ITS4 e ITS5) del rDNA los cebadores universales ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (^{White et al., 1990}; ^{Ruiz et al., 2017}). Para la amplificación, se emplearon las siguientes condiciones, una etapa inicial de desnaturalización a 94 °C por 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 s, alineamiento a 60 °C por 30 s, extensión a 72 °C por 10 min (^{Ruiz et al., 2017}). La amplificación se visualizó en un gel de agarosa al 1 % mediante electroforesis (^{Ochoa et al., 2012}). Posteriormente, los productos de PCR fueron secuenciados por la empresa Macrogen (Rockville, Maryland, EUA). Las secuencias resultantes, se compararon con las reportadas en la base de datos del banco de genes del NCBI (^{National Center for Biotechnology Information, 2018}) mediante el programa BLAST (^{Altschu et al., 1990}) para verificar el porcentaje de identidad correspondiente a las especies identificadas.

Descripción de síntomas de pudriciones de fruto en campo

Los síntomas de pudriciones secas y blandas se encuentran en las huertas distribuidas de manera irregular, independientes o asociadas. Sin embargo, los frutos con pudriciones secas se pueden encontrar en diferente tamaño (a partir de 6 cm de diámetro y 8 cm de longitud), las pudriciones aparecen en cualquier parte de la epidermis de los frutos, como manchas ligeramente hundidas de 2 a 3 mm de diámetro que pueden desarrollarse de manera independiente o unirse para formar pudriciones de hasta 10 cm de un color marrón a negro (Figura 1a). El síntoma puede abarcar hasta 10 mm, pero cuando se asocia a B. cubensis la profundidad varía en función a la posición de la semilla de donde emerge el adulto de la plaga (Figura 1b), en algunas ocasiones se pueden observar acérvulos sobre el necrosamiento. Los frutos logran madurar de manera irregular a pesar de la pudrición. En el caso de las pudriciones blandas de fruto, los síntomas aparecen inicialmente en el receptáculo floral, posteriormente la pudrición avanza a la pulpa y a la cáscara del fruto, en un estado avanzado de pudrición, la cáscara se torna de color café y la pulpa y receptáculo floral se comienzan a teñir de un color negro intenso (Figura 1c), los frutos se momifican y no logran llegar a su madurez fisiológica y se quedan adheridos al árbol, lo que se confunde en la mayoría de los casos con un aborto de fruto. Muchos de los frutos momificados presentan acérvulo por parte de Colletotrichum sp.

Figura 1 Frutas de guanábana recolectados en campo con síntomas de pudrición: a) Pudrición seca, b) Pudrición asociada con Bephratelloides cubensis, c) Pudrición blanda de fruto. 

Aislamiento e identificación morfológica de hongos asociados a pudriciones de frutos de guanábana

De los frutos de guanábana con sintomatología de pudrición seca, se aislaron e identificaron morfológicamente a los hongos del género Lasiodiplodia sp. con 23.53 % de aparición (4 aislados), Colletotrichum sp. 41.18 % (7 aislados), Pestalotiopsis sp. 11.76 % (2 aislados), Fusarium sp. 5.88 % (1 aislado) y Cladosporium sp. 17.65 % (3 aislados). Mientras que, en frutos con pudrición blanda se aisló a los hongos Rhizopus sp. con 16.67 % de aparición (3 aislados), Penicillium sp. 11.11 % (2 aislados), Aspergillus sp. 33.33 % (6 aislados), Fusarium sp. 5.56 (1 aislado) y Lasiodiplodia sp. 33.33 % (6 aislados).

Pruebas de patogenicidad

De los cinco géneros de hongos aislados de los síntomas de pudrición seca, sólo Pestalotiopsis sp. y Colletotrichum sp. resultaron positivos a las pruebas de patogenicidad. El hongo Pestalotiopsis sp. fue 100 % patogénico con herida y 0 % sin herida, la virulencia que alcanzó en 7 días después de la inoculación (DAI) fue de 3.91 mm, lo que indicó que el hongo sólo causa la enfermedad con daño mecánico y aunque no resultó tan agresivo, la enfermedad puede ser causa de pérdida postcosecha de frutos. En el caso de Colletotrichum sp., fue 100 % patogénico con herida y 83 % sin herida, la virulencia que alcanzó en el décimo DAI fue de 7.36 mm y 3.69 mm respectivamente. Por otra parte, de los cinco géneros aislados de los síntomas de pudrición blanda, sólo el hongo Lasiodiplodia sp. causó pudrición en 100 % de los frutos inoculados. La virulencia que alcanzó en 6 DAI fue de 9.6 cm, lo que indicó que es demasiado agresivo.

Los síntomas generados por Pestalotiopsis sp. aparecieron al segundo DAI, la lesión únicamente fue superficial y presentó coloraciones negruzcas, con tonos cafés rojizos, una consistencia dura y ausencia de micelio, correspondiente a síntomas por pudrición seca (Figura 2).

Figura 2 a) Síntomas de pudrición seca por Pestalotiopsis sp., b) Fruto de guanábana testigo, c) Conidios de Pestalotiopsis sp. 

Los síntomas generados por el hongo Colletotrichum sp. en las repeticiones sin herida aparecieron al cuarto DAI, la lesión sólo fue superficial con una consistencia seca; para las repeticiones con herida, los síntomas se mostraron al segundo DAI, donde el avance de la pudrición también fue en la pulpa, las lesiones se tornaron de un color café intenso, con una consistencia dura y seca, con una apariencia necrótica y no hubo presencia de micelio por parte del patógeno (Figura 3).

Figura 3 a) Síntoma de podredumbre seca con herida por Colletotrichum sp. b) Síntoma de podredumbre seca sin herida, c) Fruto de guanábana testigo. d) Conidios correspondiente a Colletotrichum sp. 

Los síntomas generados por Lasiodiplodia sp., aparecieron al tercer DAI, desde la base del receptáculo floral se notó un reblandecimiento en la zona, y para el día seis, el fruto se puso blando totalmente y aparecieron manchas cafés claro por todo el pericarpio, en el día nueve la cascara se momificó totalmente y tomó un color café intenso, para el día 10, la pulpa del fruto era blanda y comenzó a tomar un color negro (Figura 4).

Figura 4 a) Síntomas de pudrición blanda por Lasiodiplodia sp., b) Fruto de guanábana testigo, c) Conidio de Lasiodiplodia sp. 

Con base a este resultado se confirma por primera vez en México a C. gloeosporioides como el agente responsable de la pudrición seca de fruto de guanábana en Nayarit. Esto coincide con lo reportado por ^{Alberto & Otanes (2016)}, quienes mencionaron que C. gloeosporioides, C. acutatum y F. clamydosporum son patogénicos a frutos maduros de guanábana en Filipinas. Por otra parte, ^{Andrades et al., (2009)} asociaron a Colletotrichum spp. con la antracnosis en frutos de guanábana en Venezuela, mientras que ^{Hernández et al. (2013)} asociaron a C. gloeosporioides en frutos de A. muricata en el estado de Nayarit, México. Este hongo, también es considerado como patógeno causante de antracnosis de fruto de aguacate (Persea americana Mill.) en el estado de Michoacán, México (^{Morales et al., 2009}). En lo que respecta al hongo Pestalotiopsis sp., no fue altamente virulento, sin embargo, fue patogénico al causar una ligera pudrición seca, y es la primera vez que se reporta a este microorganismo como responsable de daños en frutos de guanábana en Nayarit, México. ^{Montiel (1997)} registró a Pestalotiopsis sp. como agente causal de la necrosis de fruto de guayaba (Psidium guajava L.) en Venezuela.

En Nayarit, ^{Hernández et al., (2013)} asociaron a L. theobromae como responsable de la pudrición blanda de fruto de guanábana, sin embargo, en esta investigación se encontró a L. pseudotheobromae como el agente causal de la pudrición blanda de fruto, y es el primer registro para Nayarit, México. ^{Nweke & Ibiam (2012)} indicaron que esta pudrición en guanábana es causada por C. gloeosporioides y R. stolonifer en Nigeria; mientras que ^{Sandoval et al. (2013)} mencionaron que L. pseudotheobromae es el responsable de la muerte descendente de ramas y se asocia a la pudrición de pedúnculo de mango (Mangifera indica L.) cultivados en la Costa del Pacifico en México. Por otra parte, ^{Awan & Akgül (2016)} determinaron que L. pseudotheobromae es un patógeno postcosecha altamente virulento en limón (Citrus limon L. Burm. f.) al dañar aproximadamente del 40 al 50 % del área de la fruta después de 5 días de inoculación en Turquía.

Con base a los resultados de patogenicidad se determina que los hongos de los géneros Lasiodiplodia sp., Fusarium sp. y Cladosporium sp. sólo están asociados con la pudrición seca de fruto, mientras que Rhizopus sp., Fusarium sp. Penicillium sp. y Aspergillus sp. están asociados a la pudrición blanda de fruto de guanábana.

Identificación molecular de los agentes causales de la pudrición de fruto de guanábana

Con base a los caracteres moleculares de los hongos causantes de las pudriciones de frutos en guanábana, se identificaron a Pestalotiopsis sp. con un 99 % de identidad con la cepa Cef-S6 (clave de acceso KX960814.1), Colletotrichum gloeosporioides con 99 % de identidad con la cepa Bpf-2 (clave de acceso KX960784.1) y Lasiodiplodia pseudotheobromae con 99 % de identidad con la cepa CEF-9 (clave de acceso MH062942.1) (^{NCBI, 2018}).