Químicos

Se compró hesperidina en polvo (formula molecular: C₂₈H₃₄O₁₅, Cas #: 520-26-13, pureza: 91%) de un proveedor comercial (Chem-Impex International Company, USA).

Animales y tratamientos

Los animales experimentales fueron 300 C. cordonix japonica (peso: 40-45 g, edad: 1-2 semanas) obtenidos de criaderos en Sivas, Turquía (39°42'34.8" N; 37°01'13.0" E). Se alojaron los animales en jaulas de metal (Çimuka, Turquía) (altura: anchura: profundidad = 20:45:90 cm) por 35 d, con un régimen de 21 h de luz: 3 h de oscuridad y una temperatura promedio de 25 ± 2 °C. Se dividieron los animales en tres grupos de cien aves, según el tratamiento, y dentro de los grupos había cinco réplicas de veinte aves. En el primer tratamiento se alimentaron las aves con 0 g hesperidina/kg de la dieta basal (Control), en el segundo la tasa fue de 1 g hesperidina/kg de la dieta basal (HES1), y en el tercero fue de 2 g hesperidina/kg de la dieta basal (HES2). El protocolo del estudio se aprobó por el Comité Local de Ética en Experimentos Animales de la Universidad de Sivas Cumhuriyet (Comité de Ética Aprobación # 327/2022).

Se formularon las dietas siguiendo las recomendaciones del National Research Council (NRC)¹⁸ (Cuadro 1). Tanto el alimento granular como el agua estaban disponibles ad libitum. Se implementó un periodo de adaptación al ambiente y al alimento de una semana anterior al comienzo del periodo de estudio. Las dosis de hesperidina administradas se calcularon basado en un estudio previo³. Se cuantificaron cuatro parámetros en cada tratamiento: química sanguínea, actividad antioxidante, histomorfología intestinal y conteo microbiológico fecal.

Recolección de muestras

Al final del periodo de estudio (35 días), se mantuvieron los animales en ayuno por seis horas antes de sacrificarlos. Un total de 24 animales (ocho de cada tratamiento) se sacrificaron y se procesaron en un rastro comercial bajo condiciones higiénicas. Se colectó muestra de sangre de cada animal en tubos de recolección y se centrifugó a 3,000 rpm por 10 min para separar el suero. El suero que se obtuvo se transfirió a tubos de microcentrifuga de 2 ml (Eppendorf, Alemania). Las muestras de suero se guardaron a -80 °C hasta llevar a cabo los análisis. Después de extraer los órganos internos, se guardaron los canales de manera individual en bolsas de plástico y se almacenaron a 4 °C por 24 h. Se tomaron muestras de suero sanguíneo, músculo (Musculus gastrocnemius) y tejido hepático de cada canal y se guardaron a -80 °C hasta llevar a cabo los análisis.

Parámetros de la sangre

Se procesaron las muestras de sangre con un analizador automático (Mindray BS200, China), midiendo los parámetros de Tchol (colesterol total); BUN (nitrógeno en urea de la sangre); ALT (alanina aminotransferasa); AST (aspartato aminotransferasa); GGT (gamma-glutamiltransferasa); ALP (fosfatasa alcalina); TP (proteína total); TG (triglicéridos); CK (creatinina quinasa); LDH (lactato deshidrogenasa); Ca (Calcio); Mg (Magnesio); P (Fósforo); urea; creatina; y albúmina.

Parámetros de los tejidos

Después de homogenizarse, tanto los tejidos hepáticos como los de los músculos se analizaron con kits (ELABSCIENCE): GSH (glutatión reducido) (E-BC-K030-M); SOD (E-BC-K022-M); CAT (E-BC-K031-M); MDA (malondialdehido) (E-BC-K298-M); y LPO (peroxidación lipídica) (E-BC-K176-M), correspondientes a las absorbancias de las muestras de suero y tejidos calculadas.

Histomorfología intestinal

Se tomaron muestras de íleon, ciego y colon en recipientes de tejido para preparación histológica con una fórmula tampón al 10%. Se lavaron con un flujo constante de agua potable durante 48 h. Se tomaron secciones de 5 µm de espesor de los tejidos, las cuales se procesaron con un método histológico rutinario, y se suspendieron en parafina. Las secciones se tiñeron con hematoxilina-eosina para identificar las estructuras histológicas generales y llevar a cabo las mediciones histométricas¹⁹. Se observaron bajo un microscopio (Zeiss Primo Star, Alemania) y se tomaron imágenes. Usando el software de ImageJ, se midió la altura y el ancho de las vellosidades, y la profundidad de las criptas, de diez tramos de intestino ubicados en diferentes porciones de tres secciones de intestino de cada animal. La altura de las vellosidades se midió como la distancia vertical desde los puntos de las vellosidades hasta el inicio de las criptas, el ancho de las vellosidades se midió a la altura media de las vellosidades, y la profundidad de la cripta se midió como la distancia vertical desde la unión entre la vellosidad y la cripta hasta el límite inferior de la cripta²⁰.

Conteos microbianos fecales

Se recogió de manera aséptica un gramo de contenido fecal de cada animal y se homogeneizó con 9 ml de agua con peptona al 0.1%. Se realizaron diluciones seriadas de diez veces en agua de peptona estéril de 10^-1 a 10^-6, y 0.1 ml de las últimas tres diluciones se colocaron en placas por duplicado en los respectivos medios selectivos.

Los recuentos de Escherichia coli se realizaron en agar de triptona bilis x-glucurónido (TBX) y las placas se incubaron durante 24 h a 37 °C. Los enterococos se cultivaron en agar Slanetz Bartley (SB, Oxoid CM377, Inglaterra) y se enumeraron después de 24-48 h de incubación a 37 °C. Las enterobacterias se cultivaron en agar de bilis rojo violeta con glucosa (VRBG, Oxoid CM485, Inglaterra) mientras que los coliformes se cultivaron en agar de bilis rojo violeta (VRB, Oxoid CM107, Inglaterra). En ambos casos se utilizó la técnica de vertido en placa y se enumeraron después de 24-48 h de incubación a 37 °C. Se utilizó base de agar de triptosa sulfito cicloserina (TSC Agar) (Merck 1.11972, Alemania) para el recuento de Clostridium. Las placas se incubaron durante 24 h a 45 °C en condiciones anaeróbicas, y se incluyó el indicador anaeróbico (Mitsubishi Gas Chemical, America) para monitorear las condiciones atmosféricas. A las placas de Petri (90 mm x 15 mm) (Fırat Plastic, Turquía) en que se observaron de 30 a 300 colonias se hicieron recuentos con un contador de colonias²¹. Los recuentos se expresaron como log¹⁰ UFC por gramo de contenido fecal.

Análisis estadístico

Los resultados demostraron una distribución normal para todos los parámetros. Se analizaron los datos con un análisis de variación de una vía (ANOVA), y se hicieron comparaciones entre los grupos por medio de una prueba de comparaciones T2 de Bonferroni y Tamhane (P<0.05). Todos los análisis estadísticos se hicieron con el paquete estadística SPSS 20.0.

Parámetros del suero sanguíneo

Los niveles séricos de la alanina transaminasa (ALT) y la lactato deshidrogenasa (LDH) en los tratamientos HES1 y HES2 no fueron diferentes al Testigo (P<0.05). La aspartato transaminasa (AST) disminuyó en HES2 en comparación al testigo y HES1 (P<0.05). En contraste, la amilasa fue más alta en HES2 que en el testigo (P<0.05) (Cuadro 2). No se encontraron diferencias entre los tres tratamientos en los parámetros de Tchol, TG, GGT, ALP, CK, BUN, Albúmina, TP, Urea, Creatina, Glucosa, Ca, Mg y P (P>0.05).

Parámetros de los tejidos

En el tratamiento HES1, el nivel de GSH aumentó en los tejidos de muslo, hígado y la sangre en HES1 en comparación con el Control (P<0.05). En cambio, el GSH disminuyó en el tejido del muslo en HES2. El nivel de LPO aumentó en el muslo y la sangre en el HES1. En HES2, este parámetro disminuyó en tejido del muslo, pero aumentó en la sangre. En el tejido hepático, la LPO fue más baja en HES1 y HES2 que en el testigo (P<0.05). En ambos tratamientos de hesperidina el nivel de CAT disminuyó en el tejido del muslo (P<0.05), pero aumentó en el tejido hepático (P>0.05). En la sangre, la CAT disminuyó en HES1 y aumentó en HES2 (P<0.05). El nivel de MDA disminuyó en los tres tejidos en ambos tratamientos (P<0.05). También en ambos tratamientos, el nivel de SOD en el tejido del muslo fue más bajo que en el testigo (P<0.05), pero en el tejido hepático fue más alto (P<0.05). Comparado con el testigo, el SOD en el tejido sérico disminuyó en HES1 y aumentó en HES2 (P>0.05) (Cuadro 3).

Histomorfología intestinal

En los tejidos del íleon, ciego y colon, las vellosidades fueron más altas en HES1 y HES2 que en el Control (P<0.05) (Cuadro 4). Las criptas en el colon fueron más someras en HES1 y HES2 que en el Control (P<0.05) (Figura 1).

Control: íleon (A), ciego (D) y colon (G); HES1: íleon (B), ciego (E) y colon (H); HES2: íleon (C), ciego (F) y colon (I). a: altura de las vellosidades, b: anchura de las vellosidades, c: profundidad de las criptas. Tinción hematoxilina-eosina x10.

Figura 1 Imágenes histológicos de los tejidos del íleon, ciego y colon en C. cordonix japonica alimentados con dietas que contenían hesperidina 

Conteos microbianos fecales

En la microflora fecal, los conteos de Clostridium spp. fueron más bajos en HES2 que en el Control (P<0.05) (Cuadro 5). No hubo diferencias entre los tratamientos en los conteos de Escherichia coli, Enterococcus spp., Coliform spp. y Enterobactericeae (P>0.05).

Bioquímica sérica

Los suplementos antioxidantes en alimentos pueden mejorar la fisiología y las características de rendimiento en los animales al influenciar los procesos metabólicos¹⁷. Los flavonoides cítricos, como la hesperidina y la naringina, se obtienen de las frutas cítricas y sus jugos. Como suplementos se han asociado con niveles más bajos de colesterol y triglicéridos en animales^22,23. El efecto hipocolesterolémico de la hesperidina está mediado por una disminución en la actividad de la HMG-Co A reductasa²⁴. En los presentes resultados la suplementación con hesperidina no bajó los niveles de triglicéridos ni de colesterol (P>0.05).

Las enzimas ALT, AST y LDH pueden afectar a la salud y están relacionadas con la función hepática; los niveles bajos son más deseables. Algunos suplementos alimenticios pueden reducir los niveles de estas enzimas. Por ejemplo, en ratas dosificadas con 5 g/kg de flavonoides de manera diaria se observó que las concentraciones de ALT y AST disminuyeron en comparación con un control²⁵. En gallinas ponedoras, se ha reportado que las actividades de AST y ALT se redujeron de manera significativa con la administración de propóleos a niveles de 250, 500 y 1000 mg/kg²⁶, y de 100 y 150 mg/kg²⁷. Este coincide con los presentes resultados ya que en los tratamientos que contenían la hesperidina los niveles de ALT, AST y LDH disminuyeron, aunque el motivo no está de todo claro.

Los compuestos antioxidantes en la dieta, como los bioflavonoides, pueden brindar cierta protección contra la etapa temprana de la diabetes y el desarrollo de sus complicaciones. Se ha informado que la hesperidina reduce de manera significativa la glucosa en la sangre²⁸. Sin embargo, a diferencia de estudios previos, la concentración de glucosa sérica en los presentes resultados aumentó ligeramente en los tratamientos con hesperidina (P>0.05). Investigaciones sobre la concentración de la insulina plasmática podría ayudar a entender mejor las causas tras este aumento.

Enzimas oxidantes y antioxidantes

Las concentraciones de la enzima SOD fueron más bajos en los muslos en los tratamientos con hesperidina que en el testigo, pero no demostraron cambios en el hígado. En términos generales, un descenso en este parámetro de oxidación en respuesta a la hesperidina indica que este flavonoide puede terminar la oxidación por medio del añadimiento de átomos de hidrógeno a los radicales libres. En las condiciones fisiológicas, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) está regulada tanto de forma endógena como por la suplementación con antioxidantes^29,30. Las principales enzimas antioxidantes endógenas son la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y la glutatión peroxidasa (GPX)³¹. La SOD convierte el peróxido de hidrógeno (uno de los radicales superóxido) en oxígeno y agua en respuesta a la acción de CAT y/o GPX. Mientras que la SOD y la GPX se forman en muchos tejidos³², la CAT está notablemente presente solo en el hígado, los tejidos renales y los glóbulos rojos³³. Las membranas de las células inmunitarias están compuestas de ácidos grasos altamente poliinsaturados, lo que las hace muy sensibles al estrés oxidativo³⁴. Por lo tanto, tienen altas concentraciones de enzimas antioxidantes porque la señalización relacionada con la membrana, y la expresión génica, son fundamentales para mantener la funcionalidad de las células inmunitarias³². Los resultados del presente estudio sugieren que las concentraciones de GSH en la sangre y el muslo, y de CAT en la sangre y el hígado, aumentaron en relación con el nivel de la suplementación con la hesperidina. Algunos estudios previos apoyan este resultado. En un experimento que se realizó con ratas durante una prueba de fatiga, se reflejó la baja concentración de hesperidina en la actividad de SOD³⁵. En otros dos estudios, la adición de hesperidina y naringina (0.5-4.0 g/kg) a las raciones de pollos de engorde incrementó la concentración de SOD^36,37.

Los resultados mostraron que la adición de la hesperidina a la alimentación de C. cordonix japonica disminuyó las concentraciones de la MDA en el muslo y la sangre. Estudios previos hechos con pollos de engorda coinciden con estos resultados. Cuando se adicionó pulpa de uva (1, 5, 3 y 6%) a la dieta de pollos las concentraciones de MDA bajaron en comparación con la dieta testigo^38,39. En otro estudio, la adición de una mezcla comercial de aceites esenciales (0.05 % de la dieta), bajó la concentración de MDA en los músculos de la pechuga en un 22.4 %, y en los del muslo en un 62.3 %⁴⁰. Finalmente, la inclusión de hesperidina (0.15 y 0.3 %) en las raciones de pollos de engorda redujo la concentración de MDA en el músculo de la pechuga⁴¹. Debido a la disminución en los niveles de la MDA observada en el muslo y el hígado en los presentes resultados se esperaría una disminución de la LPO, un parámetro esencial para cuantificar el daño tisular. Esto se debe a que la composición de la grasa corporal de las codornices adultas es rica en ácidos grasos insaturados, y, en parte, eso se deba al aumento en el uso de la hesperidina en las dietas para codornices en los últimos años^11,12.

Histomorfología intestinal

Después de la administración oral, los sulfatos de hesperidina se conjugan y se absorban en el duodeno y el íleon. Solo se puede absorber una pequeña cantidad de glucósidos flavonoides en el intestino delgado⁴², y la ausencia del glucurónido en el tejido intestinal en los resultados puede deberse a una restricción en su penetración tisular⁴³.

La adición de la hesperidina al alimento de C. cordonix japonica promovió el crecimiento de vellosidades más altas, pero criptas más someras que en el testigo; esto se observó en el íleon, el ciego y el colon. Los flavonoides naturales (por ejemplo, las plantas ricas en flavonoides) y sus extractos tienen efectos positivos sobre la inmunomodulación y el intestino; incluso pueden aumentar la longitud de las vellosidades y la superficie del intestino delgado en los pollos de engorda ^(44-46. En un estudio que coincide con los presentes resultados, la inclusión de hesperidina a raciones para pollos de engorda incrementó tanto la longitud como el ancho de las vellosidades a los 21 y 42 días, y disminuyó la profundidad de la cripta a los 21 días (duodeno + íleon) y a los 42 días (solo duodeno)²⁰. Los compuestos flavonoides que mejoran la morfología intestinal, cuantificada en términos de la altura y el ancho de las vellosidades, pueden estimular la mitosis de las células epiteliales. Las vellosidades más largas o más gruesas están asociadas con la mitosis activa, y se cree que las vellosidades continúan absorbiéndose a largo plazo sin necesidad de regeneración y con una profundidad de cripta reducida. Se cree esto porque se considera la cripta como una fábrica de vellosidades, ya que una cripta grande presenta una rápida transformación tisular en respuesta a la inflamación causada por patógenos y/o toxinas ^(47,48. Un aumento en la relación entre la longitud de las vellosidades y la profundidad de las criptas, como lo que se presentó en los presentes resultados, también se ha reportado con la adición de la genisteína y la hesperidina a dietas para pollos, y se puede considerar como una mejora en el sistema digestivo⁴⁹.

Conteos microbianos fecales

Los extractos de las plantas se utilizan de manera comercial en la producción animal por sus efectos antimicrobianos y el mejoramiento en al desempeño productivo. Por ejemplo, los compuestos fenólicos y los aceites esenciales de origen vegetal tienen efectos antimicrobianos^16,50. La flora intestinal en el colon promueve la absorción de ciertos nutrientes, incluyendo a los polifenoles, de la dieta, y de ellos forman moléculas bioactivas y absorbibles a partir de sus compuestos⁵¹. Los metabolitos, que consisten tanto en polifenoles como en flora, pueden tener efectos positivos en la salud del animal⁵². Los metabolitos de polifenoles derivados de la microflora en el huésped proveen numerosos beneficios⁵³.

La adición de la hesperidina a las dietas de las codornices en el presente estudio solo bajó los conteos de Clostridium spp. en HES2, sin afectar a las otras cepas probadas. El efecto levemente negativo observado en Clostridium spp. podría deberse a que los flavonoides demuestran una baja biodisponibilidad y una mala absorción en el tracto gastrointestinal, y desde luego pueden afectar a la salud intestinal^54,55. De hecho, los compuestos fenólicos poseen propiedades bactericidas⁵³ y bacteriostáticas⁵⁴. Pueden minimizar la adhesión de bacterias patógenas (E. coli, Clostridium spp.) a la pared intestinal y prevenir las infecciones en el tracto digestivo, además de mejorar el uso de nutrientes y el rendimiento en los animales^55-58.

Estudios previos sobre el efecto de suplementos bioactivos en dietas de animales en los conteos microbianos han tenido resultados mixtos. La adición de polifenoles a raciones para lechones no tuvo efecto sobre los conteos de E. coli y Clostridia spp. en heces a los 11 y 21 días⁵⁹; esto coincide de manera general con el presente estudio. En cambio, la inclusión del aceite de tomillo y/o el aceite de ajo en dietas para pollos de engorda causó una notada disminución en los conteos de Clostridium spp. en el íleon⁶⁰. Finalmente, la suplementación de extracto de arándano (80 mg/kg de alimento), una fuente de ácido fenólico, antocianina, flavonol y flavan-3-ol, a las raciones de pollos de engorda disminuyó los conteos de Enterococcus spp. a los 28 días⁶¹.