Obtención de la muestra

Las hojas y tallos de J. cardiophylla (Figura 1) se colectaron el mes de agosto de 2018 en cuatro áreas circundantes del municipio de Hermosillo, Sonora, México (área 1: 28° 52' 7.23'' N 110° 44' 8.62'' O, área 2: 29° 00' 47.8'' N 111° 02' 21.3'' O, área 3: 29° 12' 19.2'' N 111° 44' 01'' 20.7 O y área 4: 29° 10' 59.2'' N 110° 55' 51.8'' O). Se seleccionaron 6 individuos sanos por cada área, y se colectaron tallos con abundante hoja obteniendo un peso aproximado de 200 g por individuo, los cuales se almacenaron en bolsas de papel de 50 x 20 cm.

Figura 1 Jatropha cardiophylla. Planta completa (A), tallo con hojas y semillas (B), secreción similar a sangre en el tallo (C), hojas similares a un corazón (D) y flores (E). Fotos tomadas por Marcos Leon-Bejarano y Rosario Alejandro Trasviña-Mendoza. 

Procesamiento de la muestra

Las hojas y los tallos fueron secados individualmente en un horno al vacío a 60 °C y posteriormente pulverizados con ayuda de una licuadora industrial. Las muestras pulverizadas se llevaron a un tamaño de partícula menor a 1 mm mediante un molino de martillo (Thomas-Wiley Laboratory Mill Model 4). Después, la muestra se mantuvo en un frasco ámbar a 4 °C hasta su utilización.

Preparación de los extractos

Los extractos etanólicos se obtuvieron siguiendo la metodología descrita por ^{Xu et al. (2016)}, con modificaciones. La muestra se mezcló vigorosamente con la solución de etanol al 60% en una relación de 1/30 (p/v). La mezcla se sometió a sonicación por 15 min (Branson Sonicador, model 1510, USA) y se centrifugaron (Centrifuge IEC CL3 IR, Thermo Electron Industries SAS, Chaâteau-Gontier, Mayenne, France) a 5,000 g por 15 min a 4 °C. El sobrenadante se filtró con papel Whatman #4. Este proceso de extracción se repitió nuevamente y el extracto final se llevó a sequedad en un rotavapor (Labconco, USA) y se liofilizaron (FreeZone 4.5, Labconco, Kansas City, MO, USA). El extracto resultante se mantuvo en un frasco ámbar a 4 °C hasta su análisis. Para los ensayos de actividad antioxidante, el extracto se disolvió en una solución de etanol al 60%.

Análisis de HPLC-DAD

Para la identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos los extractos se sometieron a un proceso de hidrólisis ácida (^{Hilbig et al. 2018}). Se dejaron 150 mg de cada extracto en 12 mL de ácido clorhídrico 2M por 2 h a 80 °C con agitación constante. La mezcla se dejó enfriar y se ajustó a un pH de 2 con una solución de NaOH. Posteriormente, se realizó una extracción de 18 mL de éter etílico por tres ocasiones, las fases orgánicas fueron recolectadas y combinadas. Finalmente, el solvente se eliminó con un rotavapor a 28 °C y el extracto resultante se liofilizó.

El extracto hidrolizado se resuspendió en metanol puro y se filtró con microfiltro de nylon (0.20 μL) en un vial para su inyección (50 μL) en el equipo de HPLC-DAD (Agilent 1,200, Santa Clara, California) equipado con una columna C18 (25 cm x 4 mm x 5 μm) (Supelcosil, Sigma). La fase móvil consistió en agua acidificada al 1% con ácido acético (A) y metanol (B) con el siguiente gradiente de elución de 1 mL/min: 90% de A de 0 a 27 min, de 90 a 60% de A en 28 min, 60% de A por 5 min, de 60% a 56% de A en 2 min, 56% de A por 8 min, de 56% a 90% de A en 1 min y 90% de A por 4 min. (^{Nour, Trandafir & Cosmulescu, 2013}). Los cromatogramas fueron obtenidos a una longitud de onda de 254, 278, 300 y 360 nm. Posteriormente la identificación de los compuestos fenólicos en la muestra, se realizó comparándolos con los tiempos de retención de los estándares puros (Sigma-Aldrich). Estos compuestos fueron cuantificados utilizando curvas patrón de los estándares correspondientes. Los resultados se reportaron como mg del compuesto fenólico por gramos de peso seco de la muestra (mg/g PS). El análisis se realizó por triplicado.

Confirmación de compuestos fenólicos por ESI-IT-MS-MS

Para la confirmación de los compuestos fenólicos de los extractos etanólicos de la parte aérea (hojas y tallos) de Jatropha cardiophylla, se realizaron inyecciones de10 μg/mL por infusión directa a un espectrómetro de masas con electro spray y trampa de iones (FIA-ESI-IT-MS/MS, Varian 500 MS, Santa Clara, CA, EUA). El análisis fue por ionización negativa, utilizando nitrógeno, como gas nebulizador y helio como gas de colisión. El intervalo de análisis fue de 100-2,000 m/z. Los iones negativos de los compuestos fenólicos se obtuvieron bajo un flujo de infusión de 10 μg/mL, voltaje de -17 kV, una temperatura de capilar de 350 °C y un flujo de gas auxiliar de 1 mL/min. La manipulación del extracto se realizó en condiciones de oscuridad (^{Vega-Ruiz et al., 2021}).

Actividad antioxidante por inhibición del radical ABTS

El radical catiónico ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico) ABTS•+ fue preparado haciendo reaccionar una solución madre de ABTS (7 mM) con persulfato de potasio 2.45 mM (concentración final) y dejando la mezcla reposar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 16 h antes de su uso. La solución de trabajo de ABTS•+ se obtuvo diluyendo 500 μL de la solución madre en 35 mL de etanol, hasta una absoibancia de 0.7 ± 0.02 nm a 750 nm. (^{Re et al. 1999}; ^{Miller, Rice-Evans, Davies, Gopinathan & Milner, 1993}). En un tubo de ensaye de vidrio se mezclaron 20μL del extracto con 2 mL del ABTS•+ previamente preparado, y se dejó incubar por 5 min. Posteriormente, se colocaron 250 μL en una microplaca de 96 pozos y se realizó la lectura de absorbancia a 750 nm utilizando un lector de microplacas (Varioskan LUX Multimode Microplate Reader, Thermo Scientific, Vantaa, Finland). Los resultados fueron expresados como nmolET/g, utilizando una curva estándar de trolox. El ensayo se realizó por triplicado.

Actividad antioxidante por inhibición del radical DPPH

El radical DPPH se preparó mezclando el reactivo DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) en etanol (50 mM). La absorbancia de la solución de trabajo se ajustó a 0.70 ± 0.02 a 516 nm. El experimento se llevó a cabo en microplacas de 96 pocillos donde se agregaron 20 μL del extracto a cada pozo y 180 μL de solución de trabajo DPPH. Luego, la placa se incubó en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente y se realizó la lectura a 516 nm. Los resultados se expresaron como nmo1ET/g), utilizando una curva estándar de trolox. El ensayo se realizó por triplicado (^{Brand-Williams W., Cuvelier & Berset, 1995}).

Poder Antioxidante Reductor del Hierro (FRAP)

El ensayo FRAP se realizó de acuerdo con lo descrito por ^{Benzie & Strain (1996)} con modificaciones. El reactivo FRAP se preparó mezclando una solución amortiguadora de acetato de sodio (pH 3.6, 0.3 M), una solución 10 mM de 2,4,6-tri (2-piridil)-s-triazina (TPTZ) en HCl 40 mM y una solución acuosa de FeCl₃ 20 mM en una relación 10:1:1, respectivamente. En una microplaca de 96 pozos se colocaron 20 μL del extracto y 280 μL del reactivo FRAP, se dejó incubar por 30 min y se realizó la lectura de absorbancia a 750 nm. Los resultados se expresaron como nmo1ET/g, utilizando una curva estándar de trolox. El ensayo se realizó por triplicado.

Perfil de compuestos fenólicos en los extractos etanólicos de la parte aérea de J. cardiophylla

Para identificar en el HPLC-DAD a los compuestos fenólicos del extracto etanólico de la parte aérea de J. cardiophylla, se realizó un proceso de hidrólisis para la obtención en forma libre de estos compuestos. Con el análisis de HPLC-DAD se identificaron inicialmente 13 distintos compuestos fenólicos, de los que se confirmó por ESI-IT-MS-MS la presencia de 10, cuyas concentraciones se muestran en la Tabla I. Dentro de los 10 compuestos fenólicos, el ácido gálico presentó la mayor concentración, seguido de la epicatequina, el ácido protocatecuico y el ácido cafeico. Anteriormente, ^{Alday-Lara (2011)} encontró miricetina como compuesto fenólico principal en los extractos metanólicos de la semilla de J. cardiophylla, además de la presencia de ácidos fenólicos (ferúlico > clorogénico > sinápico > cafeico). En comparación con otras especies de la región, ^{Alday-Lara (2011)} reportó ácido sinápico como compuesto mayoritario en la semilla de J. cordata. Por otro lado, el ácido cafeico fue el compuesto predominante en los extractos metanólicos de la semilla de J. cinerea (^{Lovio-Fragoso et al. 2017}). Sin embargo, en ese estudio se analizó cualitativamente el extracto por medio de la espectrometría de masas, identificando 10 compuestos adicionales como el ácido gálico, el sinápico, el protocatecuico, el ferúlico, la epicatequina y la quercetina, que se identificaron y cuantificaron. Recientemente ^{Vega-Ruiz et al (2021)}, reportaron la composición fenólica de extractos metanólicos de la parte aérea de J. cinerea y J. cordata. De acuerdo con los autores, el compuesto de mayor concentración en las hojas de ambas especies fue el ácido gentísico; mientras que, la epicatequina y la quercetina, fueron los compuestos mayoritarios en los tallos de J. cinerea y J. cordata, respectivamente. De igual forma, los autores destacan las diferencias tanto en la composición como en la concentración de los compuestos entre los tejidos estudiados (hoja y tallo), que concuerda con lo mencionado anteriormente. En términos generales las especies de Jatropha de la zona cercana al municipio de Hermosillo, Sonora comparten un perfil de compuestos fenólicos similar. Sin embargo, las diferencias entre los perfiles, podría interferir en la capacidad antioxidante de cada una de las especies.

Por otro lado, y como se muestra en la Figura 2, la composición del extracto no sólo cuenta con los compuestos identificados y cuantificados, sino que se pueden observar una variedad de picos, lo que nos indica la presencia de otros compuestos que también podrían estar involucrados en la capacidad antioxidante de los extractos. Por este motivo, se incluyó en el presente trabajo la confirmación de los compuestos fenólicos por ESI-IT-MS-MS, al igual que lo realizado por ^{Lovio-Fragoso et al (2017)} y ^{Vega-Ruiz et al (2021)} en otras especies de la región.

Figura 2 Cromatograma del extracto de Jatropha cardiophylla a 278 nm. Los números corresponden al compuesto fenólico listado en la Tabla I. 

Confirmación de compuestos fenólicos por ESI-IT-MS-MS

Una vez realizado el análisis de los compuestos fenólicos presentes en el extracto etanólico de la parte aérea (hojas y tallos) de Jatropha cardiophylla mediante HPLC-DAD, se llevó a cabo la comprobación de estos, por infusión directa y por espectrometría de masas (Figura 3). La identificación de cada compuesto fenólico presente en los extractos se realizó mediante fragmentación de segundo orden (MS / MS). La confirmación se realizó comparando los iones fragmentados con patrones puros (Tabla II). Entre los compuestos confirmados se detectaron compuestos libres y otros como dímeros o trímeros. En el caso de vitexina, rutina y quercitina, no se encontró evidencia en el espectro de masas, de su presencia en el extracto etanólico de la parte aérea de J. cardiophylla.

Figura 3 Ion fragmentado de dos compuestos fenólicos encontrados en la parte aérea de J. Cardiophylla mediante espectrometría de masas (ESI-IT-MS / MS). (A) Ácido gálico. (B) Dímero de [Epi] galocatequina. 

Actividad antioxidante de los extractos etanólicos de la parte aérea de J. cardiophylla

Comúnmente la actividad antioxidante de los extractos de plantas es evaluada mediante diversos métodos basados en los principales mecanismos antioxidantes, como transferencia de electrones (SET) y transferencia de átomo de hidrógeno (HAT). En este contexto, el método de FRAP se basa en la reducción del ion Fe³⁺ a Fe²⁺ mediante el mecanismo SET. Por otro lado, los métodos ABTS•+y DPPH• responden a ambos mecanismos, HAT y SET. Entre las principales diferencias de ambos métodos podemos mencionar que el método de ABTS•+ presenta mayor facilidad de interacción tanto con los compuestos lipofílicos como con los hidrofílicos, y que el método de DPPH• tiene la limitante estérica de reaccionar con moléculas de gran tamaño, aunque también se considera más selectivo que su contraparte ABTS•+, ya que este último puede reaccionar con moléculas que poseen un solo grupo hidroxilo (^{Holtz, 2009}; ^{Cerretani & Bendini, 2010}).

En este estudio, los extractos presentaron valores de 456.71 ± 2.67, 416.63 ± 3.53 y 296.26 ± 1.73 μmolET/g, en los métodos de ABTS•+, FRAP y DPPH•, respectivamente. (Tabla III). De acuerdo con lo ya mencionado se infiere que los compuestos presentes en el extracto actúan principalmente por el mecanismo SET, indicando una mayor abundancia de compuestos de mayor tamaño molecular y/o la posible presencia de compuestos lipofílicos. En comparación con otros estudios, los extractos del presente trabajo mostraron un porcentaje de inhibición del radical DPPH (~64%) similar a los extractos metanólicos de la semilla de J. cardiophylla (~48-72%) y mayor a los extractos de la semilla de J. cordata, ambas recolectadas en el estado de Sonora (^{Alday-Lara 2011}). Por su parte, ^{Wong-Paz et al. (2015)}, reportaron porcentajes de inhibición de ~15% para DPPH y ~24% para ABTS, en los extractos etanólicos del tallo-raíz de J. dioica procedente del estado de Coahuila. Diversos extractos del tallo y raíz de J. dioica recolectada en una zona semiárida del estado Hidalgo, México presentaron porcentajes de inhibición entre 17.7-44.3% para DPPH y 29.1-49.9% para ABTS (^{Gutiérrez-Tlahque et al. 2019}). En estos estudios los valores fueron inferiores a los del presente trabajo, con excepción de los extractos de raíz de J. dioica con un porcentaje de inhibición mayor. Recientemente, en un estudio realizado por ^{Vega-Ruiz et al. (2021)}, en los extractos metanólicos de las hojas y los tallos de J. cinerea se vio que el porcentaje de inhibición fue bajo en comparación con el de este trabajo por ambos métodos (<15% para ABTS y <23% para DPPH); de manera contraria, los extractos de las hojas y los tallos de J. cordata tuvieron valores mayores a los de nuestro estudio (47-54% para ABTS y 73-77% para DPPH). Es así como los resultados demuestran el potencial antioxidante de J. cardiophylla al ser comparable con otras especies de la región.

El potencial antioxidante observado en los extractos podría estar relacionado con los principales compuestos fenólicos del extracto. El ácido gálico (Figura 4) se encuentra en los tejidos vegetales en forma de éster (ésteres con glucósidos, polioles y fenoles). Sin embargo, puede estar en forma libre, derivado de un proceso de hidrólisis, en algunos alimentos como las frutas, verduras y bebidas. En forma libre, el ácido gálico es un compuesto fenólico de bajo peso molecular constituido por tres grupos hidroxilo y un ácido carboxílico unidos a un anillo aromático con una alta capacidad antioxidante, debido principalmente a su conformación estructural. Además, se ha publicado que este compuesto presenta efecto anticancerígeno, antiinflamatorio y antiviral (^{Badhani, Sharma & Kakkar, 2015}). Por otro lado, la epicatequina (Figura 4) es un flavonoide presente como O-glucósido en los tejidos vegetales (principalmente en las hojas) con un total de cinco grupos hidroxilos que contribuyen notablemente en su actividad antioxidante (^{Terahara, 2015}).

Figura 4 Estructura química de los compuestos fenólicos identificados por ESI-IT-MS-MS, presentes en el extracto etanólico de la parte aérea de Jatropha cardiophylla. Figuras construidas por Claudia Celeste Molina-Domínguez.