Cultivos de microalgas

Las microalgas se cultivaron en medio de cultivo f preparado con agua de mar a 35 ups (unidades prácticas de salinidad) filtrada y desinfectada con hipoclorito de sodio comercial al 5% (^{Guillard y Ryther 1962}). Se suministró aire continuamente mediante un soplador de 2.5 HP y los cultivos se iluminaron con 6 lámparas fluorescentes de luz blanca (6,000-6,500 lux). La temperatura se mantuvo a 25 ± 1 °C. Los cultivos de microalgas se realizaron siguiendo la técnica de transferencias sucesivas de ^{Zazueta- Patrón (2016)} utilizando las cepas Thalassiosira weissflogii (TH-W-1), Chaetoceros muelleri (CH-M-1), Tetraselmis suecica (TE-S-1) y Nannochloropsis sp. (NN-X-1). La densidad inicial de cada cultivo fue de 10,000 cel∙mL^-1 (TH-W-1), 200,000 cel∙mL^-1 (CH-M-1), 25,000 cel∙mL^-1 (TE-S-1) y 300,000 cel∙mL^-1 (NN-X-1). Los cultivos se mantuvieron hasta la fase exponencial. La densidad celular se determinó mediante conteos directos utilizando un microscopio compuesto y una cámara de Neubauer. Se tomaron muestras representativas de cada microalga para analizar la composición proximal de proteínas, carbohidratos y lípidos, así como la concentración de clorofila a y b, y el contenido total de carotenoides. Todas las muestras se mantuvieron a -60 °C hasta su análisis.

Cultivo de juveniles de Artemia franciscana

Para obtener nauplios de A. franciscana (Great Salt Lake Artemia, INVE Aquaculture, lote 7116496181), seguimos el procedimiento estándar de hidratación-decapsulación- incubación de quistes descrito por ^{Sorgeloos et al. (1986)}. Basado en análisis mitogenómicos, ^{Sainz-Escudero et al. (2021)} propusieron el nombre Artemia monica Verrill, 1869 como nombre válido de A. franciscana Kellogg, 1906 para el Linaje del Nuevo Mundo. La hidratación se realizó en agua dulce con aireación constante. Para la decapsulación se utilizó hipoclorito de sodio comercial al 5% y los quistes se incubaron durante 24 h en agua de mar (35 ups y 28 °C) con aireación e iluminación constante (2,000 lux). Después de la eclosión, los organismos de A. franciscana se transfirieron a un recipiente de 14 L con 2 Artemia∙mL^-1 y se cultivaron durante 9 días. Durante este período, A. franciscana fue alimentada diariamente con Chaetoceros muelleri según la tasa de alimentación reportada por ^{Millán-Almaraz et al. (2021)}. El agua de mar se cambió (30%) cada día. El experimento de bioencapsulación comenzó el día 9 del cultivo. Artemia franciscana se cultivó durante 9 días, ya que este tiempo es necesario para que los organismos alcancen la etapa juvenil (longitud mínima de 2.7 mm; ^{Sorgeloos et al. 1986}).

Experimento de bioencapsulación de nutrientes en juveniles de Artemia franciscana

Los cultivos de microalgas y A. franciscana se sincronizaron para que los juveniles de A. franciscana estuvieran disponibles cuando las microalgas alcanzaran la fase exponencial. Por lo tanto, pudimos alimentar a los juveniles con dietas isolipídicas. La equivalencia isolipídica de las microalgas se ha determinado en estudios previos no publicados (Tabla 1). Para ello, se tomó como referencia la microalga Chaetoceros muelleri y las condiciones experimentales se basaron en los resultados de ^{Millán-Almaraz et al. (2021)}, quienes observaron que la mayor tasa de ingestión de juveniles de A. franciscana se produjo cuando fueron alimentados on una densidad de 900,000 cel∙mL^-1 en la oscuridad. Por lo tanto, considerando el contenido de lípidos de la microalga Chaetoceros muelleri (12.84 pg de lípidos∙cel-1) y la densidad celular reportada, la dieta isolipídica consistió en 11,556,000 pg de lípidos∙mL^-1. Por lo tanto, necesitábamos 77,541 cel∙mL^-1 de Thalassiosira weissflogii, 457,482 cel∙mL^-1 de Tetraselmis suecica y 4,736,065 cel∙mL^-1 de Nannochloropsis sp. para alcanzar esta concentración (Tabla 1).

Es importante mencionar que antes del experimento, se confirmó que los intestinos estaban vacíos mediante observación directa utilizando un microscopio Olympus CH30. El experimento constó de 4 tratamientos, cada uno con una especie de microalga y 4 réplicas, dando como resultado 16 contenedores con microalga + Artemia. El control no incluyó microalgas. En total, hubo 20 unidades experimentales, cada una con una densidad de 0.5 Artemia∙mL^-1. Las unidades experimentales estuvieron compuestas por recipientes plásticos de paredes transparentes, cada uno con un volumen útil de 14 L. Durante el experimento, la salinidad (35 ups), temperatura (25 °C), aireación y oscuridad (recipientes protegidos de la luz con cortinas negras) se mantuvieron constantes. Al inicio (0 h) y al final (6 h) del experimento, se tomaron muestras de juveniles de A. franciscana para determinar la composición proximal de proteínas, carbohidratos y lípidos, así como la concentración de clorofila a y b y contenido total de carotenoides.

Análisis proximal

La composición proximal de las microalgas y los juveniles de A. franciscana se determinó con base en el peso seco de proteínas (^{Lowry et al. 1951}), carbohidratos (extracción, ^{Whyte 1987}; cuantificación, ^{Dubois et al. 1956}) y lípidos (extracción, ^{Bligh y Dyer 1959}; cuantificación, ^{Pande et al. 1963}). Para obtener las muestras, se filtró un volumen conocido de cultivo de A. franciscana a través de filtros GF/C de 25 mm Whatman. Luego, las muestras se colocaron en una estufa a 45 °C para secar y se almacenaron a -60 °C hasta su análisis.

Proteínas

Los filtros que contenían las muestras se colocaron en tubos de centrífuga y a cada uno se le agregaron 2 mL de NaOH 1 N. Posteriormente se maceraron los filtros y se agregaron 3 mL de NaOH 1 N. Luego, los tubos se cubrieron con papel de aluminio y se colocaron en un baño de agua a 100 °C durante 10 min. Posteriormente, las muestras se mezclaron y centrifugaron a 3220 x g durante 15 min y el sobrenadante se transfirió a los tubos de ensayo. Se realizó una doble extracción. Posteriormente se recogió 1 mL de cada muestra y se colocó en cada tubo de ensayo y se agregaron 5 mL de solución C. La solución C era una mezcla de las siguientes soluciones: solución A (carbonato de sodio anhidro al 2% en NaOH 0.1 N), solución B1 (sulfato de cobre al 0.5% en agua destilada) y solución B2 (tartrato de sodio y potasio al 1% en agua destilada). Después de agregar la solución C, los tubos de ensayo se dejaron reposar durante 10 min. Luego, se agregaron a cada tubo 0.5 ml de solución D (mezcla de Folin Ciocalteu y agua destilada) y se agitó vigorosamente hasta que la mezcla se volvió azul. Después de lo cual, los tubos de ensayo se dejaron reposar durante 90 min en la oscuridad. Se utilizó una celda de cuarzo de 1 cm para leer las muestras en un espectrofotómetro Hach DR5000 a una longitud de onda de 750 nm.

Carbohidratos

Los filtros que contenían las muestras se colocaron en tubos de centrífuga y se agregaron 2 mL de H₂SO₄ 1 M a cada tubo. Posteriormente se maceraron los filtros y se agregaron 2 mL de H₂SO₄ 1 M. Los tubos se cubrieron con papel de aluminio y se colocaron en un baño de agua a 100 °C durante 60 min. Posteriormente, las muestras se mezclaron y se centrifugaron a 3,220 × g durante 15 min.

Después de la centrifugación, se tomó 1 mL del sobrenadante de cada tubo y se colocó en un tubo de ensayo y se añadió 1 ml de solución de fenol al 5%. Después de reposar durante 40 min, se agregaron lentamente 5 mL de ácido sulfúrico concentrado y se mezclaron hasta que las muestras se volvieron amarillas. Finalmente, se utilizó una celda de cuarzo de 1 cm para leer las muestras en el espectrofotómetro Hach DR5000 a una longitud de onda de 485 nm.

Lípidos

Los filtros que contenían las muestras se pusieron en tubos de ensayo y se colocaron en un baño de hielo. Luego se añadieron a cada tubo 0.5 mL de agua destilada y 2 mL de metanol y se maceró el contenido. Posteriormente, a cada tubo se le agregaron 2 mL de cloroformo y 2 mL de metanol y se centrifugaron a 3,220 × g durante 15 min. Luego, se realizó una doble extracción utilizando 1 mL de metanol y 2 mL de cloroformo. Al sobrenadante obtenido de las 2 extracciones se le añadió un total de 2 mL de agua destilada y los tubos se agitaron vigorosamente para la formación de bifase. Los tubos con el sobrenadante se cubrieron con papel de aluminio y se refrigeraron durante al menos 24 h. Posteriormente se descartó la capa superior y el resto se dejó secar en estufa a 45 °C.

Al concentrado restante se le añadió un total de 3 mL de la solución ácida de dicromato de potasio al 2%, que luego se cubrió con papel de aluminio y se colocó en un baño de agua a 100 °C durante 15 min. Posteriormente, se agregaron 4.5 mL de agua destilada a cada tubo, se mezclaron vigorosamente y se enfriaron a temperatura ambiente. Finalmente, se utilizó una celda de cuarzo de 1 cm para leer las muestras en el espectrofotómetro DR5000 (Hach) a una longitud de onda de 590 nm.

Análisis de clorofilas y carotenoides totales

Se trituraron muestras de microalgas y Artemia en acetona al 100% en un baño de hielo en la oscuridad y se dejaron reposar durante 24 h en refrigeración a 4 °C. El sobrenadante se recuperó por centrifugación a 3,220 × g durante 15 min a 4 °C. Posteriormente, se realizó una doble extracción del precipitado y se mezclaron los sobrenadantes resultantes. Luego, se utilizó una celda de cuarzo de 1 cm para leer las muestras en el espectrofotómetro Hach DR5000 a 662 nm (clorofila a), 645 nm (clorofila b) y 470 nm (carotenoides totales). Las concentraciones de estos pigmentos se presentan en µg·mL^-1 y se calcularon según las ecuaciones propuestas por ^{Lichtenthaler y Wellburn (1983)}:

donde Cla es clorofila a en µg∙mL^-1, Clb es clorofila b en µg∙mL^-1, CT son carotenoides totales en µg∙mL^-1 y A es absorbancia.

Análisis estadístico

Los datos de la composición proximal, concentración de clorofila a y b, y contenido total de carotenoides de las microalgas y juveniles de A. franciscana fueron evaluados mediante las pruebas de normalidad de Lilliefors y homocedasticidad de Bartlett (^{Zar 2010}) para determinar si eran necesarias pruebas estadísticas paramétricas o no paramétricas. Cuando los datos cumplieron con los supuestos de estas pruebas, se realizó un análisis de varianza de una vía (ANDEVA). Por el contrario, cuando los datos no cumplieron con estos supuestos, se realizó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Cuando se encontraron diferencias significativas, se realizó una prueba de comparaciones múltiples de Student-Newman-Keuls (SNK) para datos tanto paramétricos como no paramétricos. Los datos analizados con pruebas no paramétricas están marcados en las tablas con un asterisco (*). Todos los análisis estadísticos se realizaron en SigmaStat v.3.5 con un nivel de significancia del 5%.

Análisis proximal de microalgas

El análisis proximal basado en peso seco (PS) reveló que el contenido de proteína de TE-S-1 (426.28 mg∙g^-1) fue mayor que el de TH-W-1 y CH-M-1 (P < 0.05; Tabla 2). El contenido de carbohidratos de TE-S-1 (231.70 mg∙g^-1) fue mayor que el de CH-M-1 y NN-X-1 (P < 0.05; Tabla 2). Por otro lado, TE-S-1 mostró el mayor contenido de lípidos (154.43 mg∙g^-1), que solo fue significativamente mayor que el de NN-X-1 (P < 0.05; Tabla 2).

Clorofila a, clorofila b y carotenoides totales en microalgas

El contenido de clorofila a de TE-S-1 fue de 12.59 pg Cla·ng^-1 PS, el valor más alto para todas las microalgas (P < 0.05; Tabla 3). El contenido de clorofila b de TE-S-1 fue de 3.64 pg Clb·ng^-1 PS y no fue significativamente diferente del de NN-X-1 (2.45 pg Clb·ng^-1 PS; P > 0.05; Tabla 3). El contenido total de carotenoides de CH-M-1 (2.98 pg CT·ng^-1 PS) y TE-S-1 (3.72 pg CT·ng^-1 PS) reflejaron las concentraciones más altas de carotenoides totales y no fueron significativamente diferentes (P < 0.05; Tabla 3).

Contenido de proteínas, lípidos y carbohidratos en juveniles de Artemia franciscana

Después de 6 h, todos los juveniles alimentados con diferentes especies de microalgas exhibieron concentraciones y porcentajes más altos de proteínas, lípidos y carbohidratos en comparación con los valores iniciales y el control (Tabla 4). Los organismos alimentados con TE-S-1 mostraron el mayor contenido de proteínas (41.12 µg∙org^-1), lípidos (11.90 µg∙org^-1) y carbohidratos (8.70 µg∙org^-1), los cuales fueron significativamente mayores (P < 0.05) que los de los otros tratamientos. Por otro lado, los tratamientos TH-W-1 y TE-S-1 mostraron mayores porcentajes de proteínas (53.36% y 54.11%) y carbohidratos (11.32% y 11.45%), mientras que TE-S-1 exhibió un mayor porcentaje de lípidos (15.66%; P < 0.05).

Clorofila a y b y carotenoides totales en juveniles de Artemia franciscana

Después de 6 h de alimentación, todos los organismos tuvieron concentraciones de pigmentos más altas que el control (Tabla 5), pero los juveniles alimentados con TH-W-1 mostraron concentraciones más altas de clorofila a (0.482 ng Cla·µg^-1 PS) y carotenoides totales (0.345 ng CT·µg^-1 PS; P < 0.05). Los alimentados con TE-S-1 exhibieron el valor más alto de clorofila b (0.131 ng Clb·µg^-1 PS).

Composición proximal de microalgas, concentración de clorofila a y b y contenido total de carotenoides

Como es de esperar, las diatomeas presentan menores concentraciones de materia orgánica que las microalgas verdes debido a que poseen frústulas con mayores porcentajes de materia inorgánica. Sin embargo, no se ha observado una tendencia en la que las proteínas, carbohidratos y lípidos exhiban valores más bajos en las diatomeas que en otras especies, como observaron ^{Renaud et al. (1999)}. En este estudio, sólo el contenido de proteínas fue mayor en las microalgas verdes que en las diatomeas.

El contenido de proteína de TH-W-1 (244.70 mg∙g^-1) fue similar al valor de 289 mg∙g^-1 reportado por ^{García et al. (2012)}. En cuanto al contenido de proteína de CH-M-1, nuestro valor fue inferior al reportado por ^{Carbajal-López (2008)} para Chaetoceros calcitrans, mientras que nuestros valores para TE-S-1 y NN-X-1 fueron superiores a los reportados por el mismo autor (274.57 mg∙g^-1 para TE-S-1 y 169.34 mg∙g^-1 para Nannochloropsis oculata). Estas diferencias podrían deberse a las diferentes especies de microalgas, medios (e.g., Carbajal-López [2008] usó medio f/2) o metodologías empleadas entre los estudios.

De manera similar, estas razones también pueden explicar las diferencias observadas en el contenido de carbohidratos y lípidos. El contenido de carbohidratos obtenido en este estudio para TH-W-1 (185.57 mg∙g^-1) fue similar al valor de 207.00 mg∙g^-1 reportado por ^{García et al. (2012)} para la misma especie. Por otro lado, ^{Carbajal-López (2008)} reportó un contenido de carbohidratos de 42.55 mg∙g^-1 para C. calcitrans, 22.25 mg∙g^-1 para TE-S-1 y 18.96 mg∙g^-1 para N. oculata, que son inferiores a los reportados en este estudio. El contenido lipídico de TH-W-1 (117.99 mg∙g^-1) en nuestro estudio fue inferior al reportado por ^{García et al. (2012)}, lo que también puede deberse a las diferencias en las condiciones de cultivo entre los estudios (e.g., diferentes medios, temperaturas y salinidades). Sin embargo, las concentraciones de lípidos de CH-M-1 y TE-S-1 en este estudio fueron superiores a las de ^{Carbajal-López (2008)} para C. calcitrans (103.27 mg∙g^-1) y TE-S-1 (86.63 mg∙g^-1). Por último, el contenido de lípidos de NN-X-1 en este estudio fue similar al reportado por ^{Carbajal-López (2008)} para N. oculata.

En este estudio, la clorofila a fue el compuesto más abundante en todas las especies de microalgas, mientras que la clorofila b fue el segundo compuesto más abundante en las microalgas verdes. Estos resultados concuerdan con los de ^{Jeffrey y Wright (2005)}. Aunque no fue evaluada en este estudio, la clorofila c, además de los 2 tipos de clorofila mencionados anteriormente, se encuentra en muchos grupos de algas marinas, incluidas las diatomeas, las algas pardas y los dinoflagelados (^{Zapata et al. 2006}). En este estudio, la concentración de clorofila a en TH-W-1 (8.93 pg Cla∙ng^-1 PS) fue superior a las reportadas por ^{Saxena et al. (2022)}, quienes registraron concentraciones que oscilaron entre 2.79 y 6.01 pg Cla∙ng^-1 PS para esta especie. De manera similar, ^{Saxena et al. (2022)} reportaron valores de clorofila a que oscilaron entre 2.60 y 4.16 pg Cla∙ng^-1 PS para Chaetoceros gracilis. Estas concentraciones fueron inferiores a las registradas en este estudio (7.50 pg Cla∙ng^-1 PS para CH-M-1). La concentración de carotenoides totales para TH-W-1 (1.96 pg CT·ng^-1 PS) en este estudio fue similar a la reportada por ^{Bhattacharjya et al. (2020)} para Thalassiosira sp. (1.50 pg CT·ng^-1). La concentración de carotenoides totales para CH-M-1 (2.98 pg CT·ng^-1 PS) en este estudio fue superior a la encontrada por ^{Goiris et al. (2012)}, quienes reportaron un valor de 2.33 pg CT·ng^-1 PS para muestras de biomasa liofilizada de C. calcitrans.

Pocos estudios han informado del contenido de clorofila b en las diatomeas. Sin embargo, ^{Ju et al. (2009)}, quienes trabajaron con Thalassiosira weissflogii, y ^{Wang et al. (2019)}, quienes analizaron Phaeodactylum tricornutu, reportaron concentraciones inferiores a las obtenidas en este estudio. En el caso de ^{Ju et al. (2009)}, estas diferencias pueden deberse a diferentes procedimientos utilizados para obtener y analizar las muestras. Respecto a ^{Wang et al. (2019)}, estas diferencias pueden deberse a las diferentes especies, medios de cultivo y temperaturas empleadas, así como a los diferentes ciclos de luz/oscuridad o a la exposición a 5 concentraciones de p-cloroanilina.

El contenido de clorofila a de TE-S-1 (12.59 pg Cla·ng^-1 PS) fue similar a las concentraciones obtenidas por ^{Abiusi et al. (2013)}, quienes cultivaron la misma especie durante 9 días utilizando LED de diferentes colores y reportaron valores de 7.00 a 16.00 pg Cla∙ng^-1 PS. Sin embargo, el contenido de clorofila b (3.64 pg Clb·ng^-1 PS) y carotenoides totales (3.72 pg CT·ng^-1 PS) obtenidos en el presente estudio fueron inferiores a los registrados por los autores mencionados anteriormente, quienes reportaron valores que oscilaron entre 6.00 y 13.00 pg·ng^-1 PS para clorofila b y 6.00 pg·ng^-1 PS para carotenoides totales.

En cuanto a las concentraciones de pigmentos, el contenido de clorofila a (7.60 pg Cla∙ng^-1 PS) para NN-X-1 obtenido en este estudio fue superior al reportado por ^{Ra et al. (2018)}, quienes reportaron valores de 4.00 a 6.00 pg Cla∙ng^-1 PS para Nannochloropsis oceanica, aunque el valor en este estudio fue similar al obtenido para N. salina (6.00 a 10.00 pg Cla∙ng^-1 PS). ^{Ra et al. (2018)} evaluaron los efectos de longitudes de onda mixtas de luz LED blanca y verde en microalgas. Sin embargo, la concentración de clorofila b (2.45 pg Clb·ng^-1 PS) en este estudio fue superior a la obtenida por esos autores, quienes reportaron concentraciones de clorofila b inferiores a 2.00 Clb∙ng^-1 PS en ambas especies. Además, la concentración de carotenoides totales (1.61 pg CT·ng^-1 PS) en este estudio fue similar a la reportada por ^{Goiris et al. (2012)}, quienes reportaron una concentración total de carotenoides de 1.65 pg CT·ng^-1 PS en N. oculata.

La temperatura y la intensidad de la luz son factores clave que afectan la productividad de las microalgas (^{Hindersin et al. 2014}). Además, la suplementación con nitrógeno y fósforo influye en la síntesis de componentes bioquímicos de las algas cultivadas (^{Rasdi y Qin 2015}). Por ejemplo, la limitación de nitrógeno y fósforo en los medios de cultivo de algas promueve la acumulación de lípidos (^{Franz et al. 2013}), mientras que el exceso de temperatura o luz induce la síntesis de carotenoides (^{Panis y Carreon 2016}). Las diatomeas en las fases exponencial y estacionaria de cosecha contienen más ácidos grasos que las microalgas verdes o las microalgas verde azules (^{Wongrat 1995}). En el caso de los carotenoides, algunas cepas de microalgas acumulan las mayores concentraciones celulares de carotenoides en la fase exponencial media-tardía de crecimiento (^{Gómez-Loredo et al. 2016}).

Composición proximal, clorofilas y contenido total de carotenoides en juveniles de Artemia franciscana

Los juveniles de A. franciscana alimentados con las dietas isolipídicas de TH-W-1, CH-M-1, TE-S-1 y NN-X-1 presentaron concentraciones y porcentajes de proteínas, carbohidratos y lípidos mayores que los del control. Sin embargo, los juveniles alimentados con TE-S-1 exhibieron concentraciones y porcentajes más altos de proteínas, carbohidratos y lípidos que aquellos alimentados con otras especies de microalgas, lo que concuerda con la composición proximal de TE-S-1. En contraste, los juveniles de A. franciscana alimentados con NN-X-1 presentaron las concentraciones más bajas de proteínas, carbohidratos y lípidos por organismo en comparación con los juveniles alimentados con las otras microalgas, lo que puede deberse a que los nauplios de Artemia no pueden digerir las especies de Nannochloropsis debido a sus rígidas paredes celulares (^{Gerken et al. 2013}).

El porcentaje de proteína de los juveniles alimentados con la dieta TE-S-1 (54.11%) en este estudio fue similar al encontrado por ^{Maldonado-Montiel y Rodríguez-Canché (2005)}, quienes reportaron un porcentaje de 53.1% para los adultos de Artemia sp. alimentados con la misma microalga. En otro estudio, Shanmugam y ^{Rajendran (2018)} obtuvieron un 55.55% de proteína en adultos de A. franciscana alimentados con Chaetoceros sp., valor superior al encontrado en este estudio con la microalga Chaetoceros muelleri (47.02%). El porcentaje de lípidos reportado por ^{Shanmugam y Rajendran (2018)} del 19.38% para adultos de A. franciscana alimentados con Chaetoceros sp. fue superior al encontrado en este estudio para juveniles de Artemia alimentados con Chaetoceros muelleri (13.18%). Sin embargo, estos autores reportaron un porcentaje de lípidos (16.06%) en organismos alimentados con Tetraselmis sp., similar al obtenido en este estudio en juveniles alimentados con Tetraselmis suecica (15.66%). ^{Sánchez-Saavedra y Paniagua-Chávez (2017)} reportaron un porcentaje de carbohidratos del 18.83% para adultos de A. franciscana alimentados con Chaetoceros muelleri, el cual es superior al obtenido en este estudio para juveniles alimentados con la misma especie (8.81%). Sin embargo, ^{Shanmugam y Rajendran (2018)} reportaron un porcentaje de carbohidratos del 15.11% (basado en peso seco) para organismos alimentados con Tetraselmis sp., que es similar al valor reportado en este estudio (11.45%) en juveniles de A. franciscana alimentados con Tetraselmis suecica.

El contenido total de carotenoides en juveniles de A. franciscana de este estudio fue mayor que los reportados por ^{Cheban et al. (2020)}, quienes obtuvieron valores de 0.06 a 0.18 ng CT∙µg^-1 PS en nauplios de Artemia salina enriquecidos con las microalgas Desmodesmus armatus, Chlorella vulgaris y Dunaliella viridis durante 24 h. Por el contrario, las concentraciones en este estudio fueron inferiores a las obtenidas por ^{Abdollahi et al. (2019)}, quienes reportaron un valor de 0.88 ng CT·µg^-1 PS para adultos de A. franciscana enriquecidos durante 4 h con β-caroteno de Dunaliella salina. No se encontraron referencias que reporten la concentración de clorofila en crustáceos ni sus posibles funciones. Sin embargo, la actividad antioxidante que previene el daño oxidativo del ADN y la peroxidación lipídica es un efecto beneficioso de la clorofila (^{Pangestuti y Kim 2011}).

Los alimentos de alta calidad, como Artemia enriquecida con microalgas, son cruciales para el éxito de los cultivos de larvas de peces, ya que estas dietas proporcionan los elementos nutricionales necesarios para respaldar la esperanza de vida, el crecimiento ideal y el sistema inmunológico de los peces (^{Madkour et al. 2022}). En este sentido, los juveniles de Artemia enriquecidos con carotenoides provenientes de microalgas, como los evaluados en el presente estudio, también pueden servir como alimento para peces ornamentales, como Xiphophorus maculatus, dado que suplementar su dieta con carotenoides mejora la coloración y la respuesta inmune de las mucosas (^{Abdollahi et al. 2019}). Además, ^{Pérez-Rodríguez et al. (2018}) estudiaron los efectos de alimentar a larvas de M. americanum con una dieta de Artemia enriquecida con la microalga C. calcitrans, reportando que el crecimiento general, la tasa de crecimiento y la supervivencia mejoraron.

En conclusión, se observaron efectos positivos en la composición proximal, la concentración de clorofila a y b y el contenido total de carotenoides de juveniles de A. franciscana alimentados con diferentes especies de microalgas después de 6 h. Los organismos alimentados con Tetraselmis suecica exhibieron los mejores resultados en términos de composición proximal y contenido de clorofila b, mientras que aquellos alimentados con dietas de Thalassiosira weissflogii y Chaetoceros muelleri presentaron los mejores resultados en términos de contenido total de carotenoides y clorofila a.