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Introducción
El término termoterapia define el uso de temperatura para el tratamiento de algunos procesos, como el inflamatorio. Cuando la temperatura aplicada es superior a la fisiológica, recibe el nombre de hipertermia. En los humanos, el rango de hipertermia dentro de límites seguros para las células de los tejidos es relativamente pequeño, de 38 a 43 °C. La hipertermia se subclasifica en moderada (de 38 a 39.5 °C) o alta (de 40 a 43 °C).1 Cada grado de incremento en la temperatura modifica de forma diferente los procesos celulares, con lo que se observan variaciones en la expresión de proteínas, incluidas las citocinas,2 así como en la proporción de células que las expresan.3 En general, la hipertermia moderada es no invasiva y se aplica en forma externa con vapor de agua o con fuentes radiantes de calor, como cojines eléctricos o compresas con reacciones químicas exergónicas. La hipertermia moderada es usada en el tratamiento de inflamación muscular o articular. La hipertermia alta suele ser invasiva, profunda para los tejidos del cuerpo humano y se aplica con electrodos colocados en puntos precisos del cuerpo, con radiofrecuencia.
El efecto de la hipertermia moderada para el control de algunas infecciones de la piel o vías respiratorias altas es conocido desde hace décadas y a pesar de que, incluso, se han diseñado equipos especializados para su aplicación, aún existen pocos estudios in vitro o ex vivo de su efecto sobre los microorganismos causales de enfermedad. La leishmaniosis es una de las pocas infecciones en las que se ha reportado el efecto de la temperatura en el tratamiento.
Las especies que conforman el género Leishmania, protozoario parásito que constituye el agente etiológico de la leishmaniosis, son termosensibles en el rango de la temperatura fisiológica humana, aunque con diferencias entre ellas, por ejemplo, las especies que ocasionan leishmaniosis visceral, como L. donovani y L. chagasi, son sensibles a 39 °C, en tanto que las que causan leishmaniosis cutánea, como L. major, L. tropica, L. amazonensis y L. mexicana, son sensibles a 37 °C.4
La termoterapia local se aplica en pacientes con leishmaniosis cutánea localizada, mediante compresas térmicas con agua caliente, rayos infrarrojos, ultrasonido, electroterapia, radiación con rayo láser de CO2 y radiofrecuencia. La radiofrecuencia utiliza un equipo con electrodos que descargan 50 °C durante 30 segundos sobre las lesiones. Su uso se ha limitado actualmente debido a que el costo del equipo es alto (alrededor de 20 000 USD) y las refacciones son poco accesibles, por lo que la reparación no resulta posible en la mayoría de los casos. Además, la radiofrecuencia para tratar lesiones por Leishmania se ha asociado a la aparición de lesiones satélites.5
Es necesario realizar más estudios preclínicos sobre el efecto de la temperatura en Leishmania para entender mejor el fenómeno y establecer bases más precisas para la aplicación de calor con mayor seguridad y eficacia. En el presente estudio se aborda el tiempo que requiere la aplicación de una temperatura fisiológica de 37 °C sobre L. mexicana, para eliminar estos parásitos y el mecanismo implicado.
Métodos
Parásitos
Se usó una cepa de referencia de Leishmania mexicana MNYC/BZ/62/M379 y tres muestras aisladas en Tabasco, México, denominadas MHOM/MX/01/Tab2, MHOM/MX/01/Tab4 y MHOM/MX/01/Tab3: fueron cultivadas a 25 °C en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco, Grand Island, Nueva York, Estados Unidos), con 5 % de suero fetal bovino (FCS, Gibco), con un pase semanal. Los parásitos aislados fueron tipificados por inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos monoclonales e isoenzimas (CIDEIM, Cali, Colombia), que demostraron fenotipo de L. mexicana.
Curvas de crecimiento
Se llevaron a cabo cultivos de parásitos con 24 horas de resiembra, se ajustaron a una densidad de 106 parásitos/mL, se homogenizaron con agitación suave y se dividieron en proporciones similares en cajas de cultivo de 25 cm2 para continuar su incubación a 25, 32 o 37 °C. Cada 24 horas, la densidad de los parásitos se determinó con hematocitómetro a los diferentes tiempos propuestos en la curva de crecimiento. Cada punto se cuantificó por triplicado, a partir de tres diferentes cajas de cultivo, las cuales fueron desechadas después de manipularlas. El número de parásitos se determinó por dos observadores. La forma de los parásitos se identificó con microscopio invertido (Axiovert 40, Göttingen, Alemania).
Cinética de exposición a 37 °C
Para la obtención de las curvas de crecimiento, las cajas de cultivo fueron incubadas a 37 °C por periodos de 0 a 72 horas y después fueron regresadas a incubación a 25 °C. Se determinó la densidad cada 24 horas.
Determinación de apoptosis
Se usó un equipo de detección de apoptosis por anexina V-FITC (Oncogene Research Products, San Diego California, Estados Unidos), el cual fue utilizado conforme a las recomendaciones del productor para identificar apoptosis en los parásitos. Al término de los periodos de incubación definidos en el experimento, el contenido de cada caja de cultivo fue transferido a un tubo de 15 mL, el cual fue centrifugado a 900 g por 10 minutos; los parásitos sedimentados fueron lavados dos veces con tampón fosfato salino con pH de 7.2. Después, los parásitos fueron resuspendidos en amortiguador de enlace y ajustados a 106 parásitos/mL. Se preparó una mezcla con 1 mL de la suspensión, 5 μL de anexina V-FITC y 5 μL de yoduro de propidio, que se analizó a los 10 minutos en un citómetro de flujo EPICS-ALTRA (Beckman-Coulter, Fullerton, California, Estados Unidos) y en microscopio de epifluorescencia.
Tinción con anticuerpos anticiclina
Se utilizaron anticuerpos anticiclinas (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, Texas, Estados Unidos): anticiclina A (anticuerpos policlonales de conejo IgG, 200 μg/mL, fluoresceína conjugada, sc-751 FITC), anticiclina B1 (anticuerpos monoclonales de ratón IgG1, 200 μg/mL, sc-245 FITC), anticiclina D3 (anticuerpos monoclonales de ratón IgG1, 200 μg/mL, sc-6283, FITC) y anticiclina E (anticuerpos policlonales de conejo IgG, 200 μg/mL, sc-481 FITC), para teñir parásitos expuestos por 30 minutos a una temperatura de 37 °C. Al término de la incubación se agregaron 5 μL de anticuerpo anticiclina por cada 100 μL de una suspensión de parásitos × 106/mL; la mezcla se incubó durante 30 minutos más a 37 °C; se añadió 1 μL de yoduro de propidio y se leyó inmediatamente en el microscopio de epifluorescencia. Se usaron parásitos en fase logarítmica o estacionada en cuatro experimentos por separado.
Resultados
Efecto de la temperatura en la forma parasitaria
Las curvas de crecimiento fueron similares a 25 o 32 °C; sin embargo, la forma parasitaria fue diferente. Se observaron promastigotes a 25 °C y formas parecidas a amastigotes a 32 °C, sin requerimiento de monocitos. Las formas se diferenciaron desde las primeras 24 horas. A 29 °C se observó la coexistencia de ambas formas, promastigotes y amastigotes; la exposición a 37 °C desde cualquiera de las dos temperaturas, 25 o 32 °C, disminuyó la cantidad de parásitos viables y, en su lugar, aparecieron formas esféricas, no refringentes, con núcleos fragmentados, compatibles con la descripción de organismos en apoptosis, que se tiñeron con yoduro de propidio y con anexina V-FITC (Figura 1). En los cultivos en fase logarítmica, la tinción con yoduro de propidio alcanzó hasta 78 %, a diferencia de un máximo de 23 % en los cultivos en fase estacionada. Los resultados fueron similares con cualquiera de las tres cepas de L. mexicana descritas.
Figura 1 Modificaciones estructurales en promastigotes de Leishmania incubados a 37 °C. Parásitos de la especie Leishmania mexicana cambian su forma al incrementarse la temperatura a 37 °C: se vuelven esféricos y los núcleos se condensan en cuerpos apoptóticos. Fotografía con luz. A: se observan promastigotes, de forma alargada, con flagelo, que no se tiñen con yoduro de propidio; B: los parásitos fluorescentes en rojo son formas esféricas.
Cinética de exposición a 37 °C
La muerte de los parásitos a 37 °C se probó en una cinética de exposición con regreso de los cultivos a 25 °C. Se observó decremento en el número de parásitos e incremento del tiempo en que comenzó la fase logarítmica. Los cultivos expuestos durante 48 horas volvieron a multiplicarse, aunque varios días después que los expuestos durante menor tiempo (Figura 2A). En cambio, la exposición por un periodo muy breve, de 15 minutos, resultó en un incremento del número de parásitos, con curvas de crecimiento que alcanzaron su pico con mayor rapidez que en la muestra control. El número de parásitos en los cultivos revisados 96 horas después de haber sido expuestos a 37 °C fue inversamente proporcional al tiempo de exposición a dicha temperatura (Figura 2B).
Figura 2 Efecto de la temperatura en las curvas de crecimiento. Parásitos de la cepa MNYC/BZ/62/M379 a una densidad inicial de 0.36 × 106parásitos/mL fueron expuestos a 37 °C por ◆0h, ▲6h, █12h, ●24 h o menos de 48 h, y regresados a 25 °C. *p = 0.023, **p < 0.0001, ANOVA. A: la densidad de los parásitos en los cultivos fue determinada cada 24 horas durante 96 horas. B: se presenta la curva de correlación entre el tiempo de exposición a 37 °C con la densidad parasitaria alcanzada a las 96 horas de cultivo, matriz de correlación de Pearson −0.891, con nivel de significación alfa = 0.05.
Identificación del ciclo celular en parásitos en apoptosis
Se usaron anticuerpos anticiclinas A, B1, D3 y E marcados con FITC y contratinción con yoduro de propidio para identificar a los parásitos que morían al exponerlos a 37 °C; los parásitos se tiñeron bien con anticuerpos anticiclinas A, D3 y E, y pobremente con anticiclina B1, lo cual confirma que los parásitos que entran en apoptosis por exposición a 37 °C requieren un ciclo celular activo, principalmente en fases S y G2. En la tinción con anticuerpo anticiclina E, la mitad de los parásitos se tiñó solo en verde y la otra mitad en verde y rojo, mientras que los parásitos morfológicamente en mitosis no se tiñeron con yoduro de propidio, lo cual indica que en la fase M del ciclo celular no se indujo apoptosis por la exposición a la temperatura de 37 °C (Figura 3).
Figura 3 Ciclo celular en la inducción de apoptosis por temperatura de 37 °C. Parásitos Leishmania en fase logarítmica fueron incubados a 37 °C por 60 minutos y teñidos con anticuerpos anticiclina A (A), anticiclina B1 (B1), anticiclina D3 (D3) y anticiclina E (E). CC: campo claro; A-C: anticuerpo anticiclina; IP: yoduro de propidio. Imagen a escala 100×.
Discusión
La temperatura de 37 °C, considerada fisiológica para el cuerpo humano, tuvo efecto letal en una proporción alta de parásitos L. mexicana cuando se encontraban en fase logarítmica del cultivo. Varios estudios han informado la inducción de apoptosis por cambios de temperatura,6-8 generalmente a 39 °C, con expresión de proteínas de choque térmico.9
En cultivo in vitro no se observó letalidad total en ninguno de los experimentos de estrés térmico, lo que sugiere que una proporción de los parásitos se encontraba arrestada en la fase G0/G1 de su ciclo celular con alta regulación negativa en la transcripción y traducción de genes, como sucede con los tripanosomátidos. Experimentos recientes muestran que el efecto de la temperatura es directamente sobre la traducción de los genes. De hecho, la regulación de la expresión del genoma de los parásitos tripanosomátidos tiene ciertas particularidades como su genoma policistrónico, lo que significa que se transcriben múltiples genes sobre un solo transcrito de ARNm, que se ve sometido a regulación postranscripcional por cortes trans y poliadenilación.10
El efecto del incremento de la temperatura en cultivos de parásitos del género Leishmania se asemeja al cambio morfológico de promastigotes a amastigotes cuando el parásito es transmitido del vector hospedero al mamífero y en sentido inverso, cuando pasa de amastigote a promastigote, al ser adquirido por un vector al alimentarse de un hospedero portador. Las bases de esta transformación morfológica involucran proteínas de choque térmico (HSP, heat shock proteins), particularmente la HSP de 90 kDa, con 11 sitios susceptibles de fosforilarse diferencialmente, que ejerce un control postranscripcional en dos niveles de los genes del parásito. En el primer lugar, un sitio susceptible de fosforilación en las serinas Ser289 y Ser526 afecta la traducción de genes que conforman el flagelo y el parásito cambia su forma reversiblemente entre amastigote y promastigote. El resto de los sitios de la serina que son susceptibles de fosforilarse son importantes para la supervivencia del parásito, pues su eliminación la hace inviable.11
El conjunto de cambios epigenómicos que suceden en Leishmania cuando el parásito se expone durante dos horas a una temperatura de 37 °C, incluye cambios en su transcriptoma que involucran a 3969 genes de 10 700 que pueden ser transcritos. Un total de 1866 genes incrementan su traducción, entre ellos los que codifican proteínas asociadas a funciones de adhesión celular y formación de proteasomas. Hay 2103 genes que disminuyen su traducción y las proteínas que codifican están asociadas a unidades de traducción de ARNm, a la biogénesis de ribosomas y al citoesqueleto.12
La temperatura también afecta la expresión diferenciada de las formas clínicas de la infección por L. mexicana. En las regiones con clima tropical húmedo y caliente se expresa la clásica inflamación del cojinete plantar de ratones infectados experimentalmente; en los climas fríos y secos, los animales infectados presentan alopecia y lesiones escamosas en las que se encuentran formas de promastigotes en la superficie de la piel.13
El efecto de incrementar la temperatura en regiones externas del cuerpo humano incluye cambios que favorecen el mecanismo de presentación de antígenos y la producción de citocinas asociadas a respuestas Th1 y Th17, así como la eliminación de patógenos intracelulares, como Leishmania.14 Además, al inducir apoptosis en el parásito, se contribuye a disminuir la densidad parasitaria en las lesiones y a facilitar la eliminación de los parásitos a través de dos efectos, uno antiparasitario y otro inductor de la respuesta inmune antipatógenos intracelulares.
Considerando que L. mexicana es sensible a 37 °C, se propone el uso de una fuente externa que genere calor regional moderado, de 42 °C, como compresas térmicas o cojines eléctricos que generan y mantienen esa temperatura durante periodos específicos que van de 20 a 90 minutos y cuya aplicación actual es para disminuir la inflamación y favorecer la distensión de lesiones musculares. A partir de los resultados se puede proponer que se apliquen incrementos locales tópicos de 40 a 42 °C, sostenidos por al menos 30 minutos, sobre las lesiones cutáneas causadas por L. mexicana, para favorecer la eliminación local del parásito.
La elevación externa de la temperatura a 42 °C es perfectamente tolerable para el organismo humano, que tiende a mantener su temperatura sistémica regular en 37 ± 0.5 °C a través de mecanismos como la sudoración, la vasodilatación y el incremento del flujo sanguíneo, regulados por el hipotálamo.15 Las personas rescatadas después de 24 a 48 horas de exposición ambiental a 42 °C han presentado un incremento de apenas un grado de su temperatura sistémica.16 Con la aplicación de aditamentos generadores de calor controlado de 42 °C en forma tópica por menos de 90 minutos no se genera el riesgo de un incremento significativo de la temperatura sistémica. Un incremento regional en el sitio de aplicación puede permear a las zonas cercanas por el mecanismo de convección a razón de 40 a 38 °C, en un gradiente de temperatura que se disipa gradualmente hasta los 37 °C en el tejido circundante. Este incremento en la temperatura sería suficiente para inducir apoptosis en parásitos de la superficie de la piel, al tiempo que se favorece su eliminación a través de la inducción de respuestas Th1 locales.
Los habitantes de zonas endémicas de leishmaniosis usan diversas infusiones administradas en paños calientes sobre las lesiones cutáneas como medida tradicional para eliminar las lesiones, pero no se controla la temperatura, ni el tiempo en que se sostiene.
