Material vegetal

Se utilizaron púas (brote terminal y segmento basal) de plantas donadoras de vivero (PDPV) y de árboles seleccionados en campo (PDPC) de un huerto semillero sexual en Pueblo Nuevo, Puebla, México (19° 57´ 35.73´´ N; 98° 06´ 22.77´´ O).

Las plantas donadoras de vivero se originaron de injertos realizados en 2016 con púas de árboles seleccionados en campo de un huerto semillero sexual de 14 años, ubicado en el vivero Insurgentes, Zacatlán, Puebla, México (19° 57´ 35.73´´ N; 98° 06´ 22.77´´ O). Las plantas se mantuvieron en macetas de 12 L (21, 27 y 31 cm en base, altura y diámetro superior, respectivamente) con sustrato compuesto por corteza, lombricomposta y tezontle (60:20:20; v: v: v) en Montecillo, Texcoco, Estado de México, México (19° 27´37.74” N; 98° 54´15.27” O), bajo malla sombra al 60 %.

Del árbol 16 del huerto semillero se recolectaron 220 púas con longitud de 8 a 12 cm y diámetro de 3.5 mm. Esta actividad se realizó un día antes de hacer el injerto; las púas se transportaron en bolsas Ziploc® en una hielera que contenía agua congelada en botellas de plástico. El mismo día de recolecta, en el laboratorio de cultivo in vitro, se eliminaron las acículas de la base de las púas (4 cm), se lavaron con agua y jabón para eliminar el polvo y se tallaron con cepillo de dientes de cerdas finas. Después se desinfestaron con Benomilo (metil 1-[butilcarbamoil] bencimidazol 2-il carbamato; 2 g∙L^-1) durante 15 min, se dejaron sobre papel estraza para eliminar el exceso de agua y se guardaron de la misma forma que se transportaron. Las púas de vivero se recolectaron (120 púas) al momento de injertar, pero no se desinfestaron; la longitud promedio fue de 15 a 20 cm. Al momento del injerto, las púas tuvieron longitud promedio de 8 a 10 cm para ambos orígenes (Figura 1).

Figura 1 Púas de Pinus greggii var. australis con brote terminal (A) y segmento basal (B) utilizadas para injertar. 

Portainjertos

En mayo de 2018 plantas provenientes de semilla de Pinus greggii var. australis, P. patula Schiede ex Schltdl. et Cham., P. teocote Schiede ex Schltdl. et Cham. y P. leiophylla Schiede ex Schltdl. et Cham de cinco meses, producidas en tubetes de plástico rígido (140 cm³) se trasplantaron en macetas cuadradas de 1 L (8.5, 12.5 y 10.7 cm en la base, altura y parte superior, respectivamente) con sustrato de corteza, lombricomposta y perlita (60:20:20 v/v/v). Las tallas variaron de 1.74 a 2.98 mm de diámetro y de 14.05 a 20.55 cm de altura. Las fertilizaciones se hicieron con 2 g∙L^-1 de solución de fosfato diamónico (DAP®) cada dos semanas por dos meses. Los portainjertos se mantuvieron en espacio protegido con malla sombra al 60 %.

En abril del 2019, las plantas de las cuatro especies se injertaron (15 meses, 3 a 4 mm de diámetro y 36 a 52 cm de altura). Pinus patula y P. greggii presentaron las alturas mayores, 52 y 49 cm respectivamente, y P. patula y P. teocote registraron los diámetros mayores, ambas con 4.3 mm. Los brotes desarrollados en la base de los portainjertos se eliminaron un mes después del injerto y, posteriormente, de acuerdo con su aparición.

Injertado y manejo posinjerto

Se realizaron 60 injertos por especie de portainjerto: 15 por cada origen (PDPV y PDPC) y 15 de cada tipo de púa (brote terminal y segmento basal); en total 240. Cabe mencionar que, para los segmentos basales de las púas de campo, el ápice principal se eliminó porque estas no tenían longitud suficiente para seccionarlas, caso contrario de las púas de vivero que en algunos casos se obtuvieron hasta dos segmentos basales. El tipo de injerto utilizado fue hendidura; la púa se injertó donde el tallo del portainjerto era verde tierno (12 cm), se amarró con cintas plásticas y se colocó una bolsa de plástico transparente (Figura 2) que cubrió por abajo de la unión, para evitar el exceso de transpiración.

Las plantas se fertilizaron con DAP^® (2 g∙L^-1), una semana después de injertadas y, posteriormente, cada tres semanas durante seis meses, intercalando con DAP^®, Yaramila complex^® (N-12 %, P-11 %, K-18 %, S-11 %, Mg-2.7 %, B-0.0015 %, y Fe, Mn y Zn-0.2 %; 2 g∙L^-1) y sustancias húmicas (1 mL∙L^-1), colocando 100 mL de solución a cada planta y Ultrasol micromix^® de manera foliar (1 g∙L^-1).

La bolsa de plástico se eliminó de la manera siguiente: una semana después del injerto se cortó una esquina de la bolsa (2 cm aproximadamente), en la segunda semana se cortó el extremo siguiente (Figura 2B), en la tercera semana se quitó la parte superior de la bolsa (Figura 2C) y en la cuarta semana se retiró completamente (Figura 2D). Las cintas para amarrar el injerto se eliminaron tres meses después.

Figura 2 Manejo posinjerto de Pinus greggii var. australis en cuatro especies de portainjertos: saturación de bolsa con vaho para disminuir transpiración del injerto (A), corte de las esquinas de bolsa (B), corte de la parte superior (C) y retiro total de bolsa y crecimiento del injerto (D). 

Diseño experimental y variables de estudio

El diseño experimental fue bloques al azar generalizado con arreglo factorial: las cuatro especies de portainjertos como bloques, los factores fueron los orígenes (PDPV y PDPC) y los tipos de púa (brote terminal y segmento basal); se tuvieron 16 tratamientos en total.

Las variables evaluadas fueron porcentaje de prendimiento (con el total de plantas por tratamiento) un mes después de injertados; incremento en altura (cm) y diámetro (mm) a los seis y 12 meses después de injertado (los diámetros se midieron 0.5 cm por arriba y abajo de la unión del injerto); relación injerto/portainjerto (diámetro de injerto/diámetro portainjerto); y número de brotes emitidos en las púas de las combinaciones tres meses después del injerto. El porcentaje de prendimiento se calculó tomando en cuenta las 15 plantas por combinación; para el resto de las variables, la muestra fue de 10 plantas por combinación de portainjertos y púas (origen y tipo). Los datos se analizaron con los paquetes estadísticos R 3.6.1 (^{The R Foundation, 2018}) y SAS 9.4 (^{Statistical Analysis System Institute, 2013}).

Los datos incremento de altura y diámetro se sometieron a un análisis de varianza y posterior prueba de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05); para la primera variable solo se utilizaron las púas de brote terminal, y el diámetro se analizó en ambos tipos de púa. El número de brotes generados en las púas de las combinaciones se analizó con regresión Poisson.

Prendimiento de injertos

Con el uso de portainjertos de 15 meses y púas de plantas donadora de vivero o recolectadas en campo, pero con crecimiento activo, se obtuvo más de 93 % de prendimiento (Figura 3). El prendimiento en los portainjertos fue de 100 % cuando se utilizó P. teocote y P. patula, mientras que con P. greggii y P. leiophylla fue de 96.5 % (Figura 3); ^{Baron, Esteves Amaro, Pina, y Ferreira (2019}) mencionan que es necesario utilizar la misma especie como portainjerto para obtener porcentajes altos de prendimiento; sin embargo, con los resultados del presente trabajo se demuestra que tal supuesto puede variar y que las especies de pino utilizadas tienen comportamiento similar a Citrus (^{Uribe-Bustamante, Curti-Díaz, Hernández-Guerra, & Ticante-Montero, 2013}); Persea (^{Salazar-García, Medina-Torres, Ibarra-Estrada, & González-Valdivia, 2016}) y Prunus (^{Gullo et al., 2014}) que pueden injertarse en otras especies.

Figura 3 Prendimiento de injertos (n = 15) con brote terminal de Pinus greggii var. australis en cuatro especies de portainjertos. PDPV: planta donadora de púas de vivero; PDPC: planta donadora de púas de campo. Evaluación al mes de injertados, mayo 2019. 

Los portainjertos de pino en especies con crecimiento lento o estado cespitoso tienen regularmente de tres a siete años (^{Pérez-Luna et al., 2019}) y las especies de pinos subtropicales de crecimiento rápido se utilizan de dos años (Aparicio-Rentería et al., 2013). Las plantas de las edades mencionadas generalmente son injertadas en zonas de mayor lignificación, porque así lo mencionan las metodologías, lo cual probablemente puede afectar el proceso de prendimiento. Dichas edades se emplean debido a que se carece de metodología para producción de plantas con fines de injerto y para que estas tengan las medidas mínimas de diámetro y altura; no obstante, con los resultados aquí presentados, en especies de crecimiento rápido se pueden utilizar plantas de 15 meses.

Con relación al origen, el prendimiento promedio fue 98 %, por lo que se pueden utilizar PDPV o PDPC con crecimiento activo. Cabe resaltar las ventajas del uso de PDPV tales como la recolecta y selección que fueron fáciles y rápidas, ya que por la altura de las plantas (1.5 m) no es necesario utilizar personal, equipo para el escalado de árboles ni gastos de traslado, como sucede para las PDPC.

El esquema de PDPV se emplea en frutales como cítricos (^{Zamora-Rodríguez et al., 2016}) y en la obtención de estacas en especies de pino (^{Martínez-Alonso et al., 2012}). En el presente estudio, el manejo proporcionado a las PDPV como podas, fertilización y aplicación de productos contra agentes patógenos generó púas adecuadas para los injertos.

Respecto al tipo de púa, con la propuesta planteada se demuestra que las de segmento basal fueron aptas para injertarse, obteniendo 100 % de prendimiento, lo cual permitió el uso eficiente del material vegetativo de los árboles seleccionados. El prendimiento promedio de ambos tipos de púa fue de 99 % (dos injertos no prendidos), debido posiblemente a que la púa de campo se recolectó un día antes de injertarla y la de PDPV tal vez estaba demasiado tierna. Los injertos se hacen regularmente con púas de brote terminal, porque las recolectadas en campo tienen longitud de 10 cm aproximadamente, lo que hace imposible el uso de segmentos basales; sin embargo, con la implementación de plantas donadoras de vivero, las púas alcanzaron longitudes de hasta 30 cm, por lo que se pueden obtener hasta tres fracciones de 10 cm aproximadamente: una con brote terminal y dos segmentos basales, lo que significa una ventaja para obtener más púas.

En los trabajos realizados en México, el prendimiento en injertos de pino es inferior de 50 %, tres meses después de injertados (Aparicio-Rentería et al., 2013; ^{Pérez-Luna et al., 2019}), debido a que no existe preparación anticipada de portainjertos y púas; además, el manejo posinjerto es deficiente. Aparicio-Rentería et al. (2013) eliminan bolsas de plástico tres meses después de injertar, tiempo suficiente para que las condiciones de temperatura y humedad dentro de la bolsa propicien la proliferación de hongos, posible causa de la muerte de injertos. En el presente estudio, la eliminación de bolsas de plástico inicia la semana posterior a la realización de los injertos y finaliza un mes después. Cabe mencionar que el porcentaje de prendimiento un año más tarde sigue siendo el mismo; por tanto, el manejo posinjerto adecuado es importante para la sobrevivencia sin importar que portainjertos y púas (tipo y origen) se utilicen.

Crecimiento e incremento en altura

Un año después de injertados, la altura de los injertos provenientes de PDPV aumentó 253.0, 300.0, 289.3 y 243.1 % y en las PDPC incrementó 227.5, 216.0, 222.1 y 179.0 % en los portainjertos de P. greggii, P. teocote, P. patula y P. leiophylla, respectivamente (Figura 4). Pinus leiophylla propició crecimientos menores, debido posiblemente a que la especie produjo alrededor de 15 brotes epicórmicos, lo que implicó competencia de nutrimentos y carbohidratos.

Figura 4 Dinámica de crecimiento promedio en injertos (n = 10) de Pinus greggii var. australis realizados en abril de 2019, utilizando púas de brote terminal. PDPV: planta donadora de púa en vivero, PDPC: planta donadora de púa en campo, ASM: altura a los seis meses (octubre 2019), ADM: altura a los 12 meses (abril 2020). 

Las púas de plantas donadoras de vivero presentaron mayor crecimiento que las de campo, lo cual indica que el esquema en espacio protegido es una excelente alternativa para tener púas con características adecuadas para el injerto, obtenidas con prácticas de manejo mediante podas, fertilizaciones, protección contra plagas y enfermedades. Los resultados también indican que no se depende de la fenología de la especie, porque las podas realizadas obligan a las plantas a brotar, tal como se hace en cítricos (^{Zamora-Rodríguez et al., 2016}).

El análisis de varianza mostró significancia para origen de púa y portainjerto (P < 0.0001) en los datos de seis meses; sin embargo, a los 12 meses solo el factor origen de púa (P = 0.0009) fue significativo. El incremento en altura de los injertos de PDPV, seis meses después, varió de 13.2 a 19.0 cm, y para los de PDPC de 6.8 a 10.4 cm. A los 12 meses, los incrementos fueron 32.0 a 35.7 cm y 22.2 a 30.2 cm en injertos de PDPV y PDPC, respectivamente.

Respecto a las pruebas de medias del incremento en altura, en la evaluación de seis meses, los injertos de PDPV tuvieron mayor incremento; para los 12 meses, los promedios para origen de púa fueron 33.98 y 27.74 cm en PDPV y PDPC respectivamente (Cuadro 1).

En ambas fechas de evaluación, los portainjertos con P. leiophylla obtuvieron los menores incrementos, sin importar el origen de la púa, debido probablemente a que la cantidad de brotes epicórmicos emitidos fue factor de competencia. En contraste, P. patula y P. greggii generaron los incrementos mayores a los 12 meses de evaluación.

Los portainjertos son pieza clave para el crecimiento del injerto, ya que este le proporcionará agua y nutrimentos que puedan ser utilizados. En especies frutales, hortícolas y ornamentales, la producción de portainjertos es una actividad que se realiza con el fin de que la planta tenga reservas suficientes para proporcionar nutrientes y carbohidratos a la púa injertada. En el caso de pinos, la producción de portainjertos hasta la fecha no ha sido prioritaria, ya que se utiliza planta producida para fines diferentes.

En especies de pino, las púas procedentes de árboles de campo son generalmente lignificadas y en ocasiones se recolectan e injertan en periodos donde las plantas están en letargo (Aparicio-Rentería et al., 2013; ^{Pérez-Luna et al., 2019}), lo cual atrasa los procesos de prendimiento y crecimiento e incluso causa la muerte de injertos. Los resultados demuestran que el crecimiento es mayor con PDPV, lo que puede acortar el plazo para plantación, siempre que las condiciones climáticas como la presencia de lluvia y ausencia de heladas lo permitan.

^{Martínez-Ballesta, Alcaraz-López, Muries, Mot-Cadenas, y Carvajal (2010}) mencionan que la conexión vascular es fundamental para el mayor crecimiento de injertos. De acuerdo con esto, los resultados con las PDPV pudieron deberse a la conexión vascular correcta, además de la nutrición proporcionada con el objetivo de tener púas con características adecuadas a la actividad. Cabe resaltar que la práctica de fertilización es poco utilizada en plantas establecidas en campo. Por otra parte, ^{Castro-Garibay, Villegas-Monter, y López-Upton (2017}) mencionan que P. teocote presenta cámbium vascular circular, haciéndolo una opción viable para fungir como portainjerto, al igual que P. leiophylla; sin embargo, con esta última se obtuvieron los menores incrementos en altura, por lo que, además de las características anatómicas de la especie, debe existir otro factor que afecte el crecimiento de las combinaciones realizadas.

Diámetro y relación injerto-portainjerto

Los diámetros de las púas generadas por las plantas donadoras en vivero fueron homogéneos (2.8 a 3.1 cm) y ninguna se descartó para su uso, en contraste con las 220 recolectadas en campo de las que se desecharon alrededor de 80, porque no cumplían con el mínimo requerido para injertarse. Esto indica que la selección y experiencia del que realiza esta actividad también son importantes.

De acuerdo con el análisis de varianza, los factores que tuvieron efecto significativo sobre el diámetro de púa fueron portainjerto (P < 0.0001) y tipo de púa (P < 0.0001), mientras que para el diámetro de portainjerto fueron portainjerto (P < 0.0001), origen (P = 0.0009) y la interacción origen*púa (P = 0.0105) a los seis meses de evaluación. A los 12 meses, los factores portainjerto, tipo de púa y origen fueron significativos para ambos diámetros, y solo la interacción portainjerto*origen (P = 0.0206) tuvo significancia para diámetro de púa. Los valores mayores de la relación injerto-portainjerto ocurrieron en las púas de segmento basal, sin importar su origen.

A los seis meses de evaluación, el mayor diámetro de injerto y portainjerto se obtuvo en las combinaciones de P. teocote con púa de segmento basal proveniente de campo (5.05 mm) y de PDPV (5.40 mm), respectivamente. A los 12 meses, la combinación de P. patula con púa de segmento basal proveniente de PDPV originó los mayores diámetros para injerto (6.41 mm) y portainjerto (6.68) (Cuadro 2). En frutales se menciona que el vigor del portainjerto está relacionado positivamente con el diámetro de la planta (^{Girardi, Mourão Filho, & Kluge, 2007}), lo que sugiere que P. patula puede catalogarse como vigoroso por presentar los mayores diámetros 12 meses después de injertado.

La relación injerto-portainjerto es un indicador sobre la compatibilidad (^{Berdeja-Arbeu, Villegas-Monter, Ruiz-Posadas, Sahagún-Castellanos, & Colinas-León, 2010}). En el caso de P. leiophylla, aunque los diámetros fueron menores, la combinación PDPC con púa de segmento basal tuvo relación 1, lo que indica que el crecimiento es homogéneo y lo mismo sucede para algunas combinaciones con P. teocote y P. patula con valores de 0.98 y 0.99, respectivamente. No obstante, a los 12 meses, los resultados con P. greggii y P. patula son más promisorios que con el resto de las combinaciones (Cuadro 2). ^{Baron et al. (2019}) mencionan que la afinidad taxonómica es un requisito para la compatibilidad de injertos eso puede explicar porque todos los valores son superiores a 0.90 en la combinación P. greggii/P. greggii a los 12 meses.

El crecimiento diferenciado de diámetro puede ser síntoma de incompatibilidad, ya que los mecanismos fisiológicos se modifican y desencadenan cambios en altura, diámetro y tamaño de copa (^{Berdeja-Arbeu et al., 2010}).

^{Aloni, Cohen, Karni, Aktas, y Edelstein (2010}) hacen referencia a la acumulación de compuestos orgánicos en la unión del injerto, que pueden causar proliferación de tejido parenquimatoso y aumento de diámetro del tallo en ambas partes, lo cual implica irregularidades anatómicas. ^{Souza, Diniz, Neves, Alves, y Oliveira (2018}) mencionan que la diferencia entre los diámetros perjudica el flujo de fotoasimilados y la conductividad hidráulica que se verán reflejados en el crecimiento de la planta.

Número de brotes

Solo los factores origen y tipo de púa tuvieron efecto significativo en el número de brotes (P < 0.0001). La mayor cantidad de brotes emitidos fue en las púas de segmento basal, debido a la pérdida de dominancia apical, ya que la concentración de citocininas aumenta (^{Tanaka, Takei, Kojima, Sakakibara, & Mori, 2006}), y con esto la proliferación y crecimiento de las yemas axilares, caso contrario para las púas de brote terminal. Las PDPV superaron en cantidad de brotes (4.4) a las PDPC (2.40), lo cual puede estar asociado a la acumulación de compuestos orgánicos debido al manejo proporcionado a las PDPV (Figura 5).

Figura 5 Brotes laterales producidos en injertos de Pinus greggii var. australis sobre cuatro portainjertos. PDPV: planta donadora de púas de vivero, PDPC: planta donadora de púas de campo, BA: brote apical, SB: segmento basal. Datos recabados tres meses después de realizados los injertos (n = 10). 

Los brotes pueden utilizarse para dar forma a la planta dependiendo del objetivo establecido. Las púas producidas por plantas en vivero presentaron mayor número de brotes en comparación con las de campo, debido quizá al manejo proporcionado a la planta donadora, lo que pudo propiciar mayor concentración de compuestos orgánicos, contribuyendo a la brotación. Después de evaluar el número, algunos brotes de las púas se eliminaron dejando dos o tres por planta para promover el crecimiento y engrosamiento de estos y formar la arquitectura de copa.

P. greggii var. australis es endémico de México; la mayoría de las investigaciones sobre la especie se han enfocado en estudios de procedencia-progenie para selección (^{Ruíz-Farfán et al., 2015}) y producción de planta en vivero (^{Castro-Garibay, Aldrete, López-Upton, & Ordaz-Chaparro, 2018}), pero con respecto a la propagación mediante injerto se carece de información. En México, en el caso de P. patula y P. arizonica se utilizan metodologías complicadas de injertación, además de prácticas pre y posinjerto deficientes (^{Aparicio-Rentería et al., 2013}; ^{Pérez-Luna et al., 2019}).

Este trabajo presenta aportes importantes para realizar injertos de P. greggii var. australis sobre otras especies de portainjertos, ya que regularmente se utilizan de la misma especie. Además, la metodología es sencilla y puede adaptarse a otras coníferas, ya que con la implementación de PDPV se tienen las ventajas siguientes: no están expuestas a condiciones ambientales de campo (polvo, sequía, ataque de plagas o enfermedades), no se depende de la fenología de la especie y existe mayor control de la fertilización y patógenos. Por otra parte, mediante podas se pueden generar varetas para injertar por lo menos tres veces al año con características de interés para el propagador, y las que aún no las tengan se dejan en la planta donadora y monitorean hasta que alcancen las medidas requeridas; por tanto, las PDPV son una excelente opción que se debe impulsar para hacer más eficiente la propagación por injerto en especies de pino. Asimismo, las PDPV, al tener altura de 1.5 m, no requieren personal especializado para la recolecta, no hay gastos de traslado y tampoco es necesaria la desinfestación de varetas antes de utilizarse, debido a que se tiene control sobre la incidencia de plagas y enfermedades en comparación con las recolectadas de árboles en campo.

En especies forestales no existe metodología establecida de producción de portainjertos. Con la presente propuesta de trasplantar plantas de cinco meses a macetas de 1 L, realizar podas de raíces, eliminar brotes laterales y hacer fertilizaciones individuales se logran portainjertos vigorosos con mejores raíces y mayor contenido de reservas que serán utilizadas por las varetas cuando son injertadas; además, al programar la siembra de especies se tendrán las plantas adecuadas y podrán utilizarse entre los meses de marzo a mayo. Cabe mencionar que por el crecimiento que presentan, las especies utilizadas como portainjertos se trasplantaron a los cinco meses; sin embargo, el crecimiento es diferente para especies cespitosas y piñoneras, por lo que hace falta determinar metodologías para la producción de portainjertos de estas especies o similares. La metodología planteada puede ser útil para propagar árboles seleccionados en campo o de ensayos de progenies que hayan sido evaluados para generar planta donadora en viveros.