Materiales y métodos

Identificación de aislamientos. Se recolectaron 45 muestras de hojas con urediniosporas de roya amarilla durante el ciclo P-V/2021 de las localidades de Terrenate, Nanacamilpa y Tlaxco, Tlaxcala; Apan, Hidalgo; Chapingo y Santa Lucia, Texcoco y Toluca, Estado de México, incluidas dentro de las zonas productoras de cebada de temporal de los Valles Altos del Centro de México. Las muestras se trasladaron, para su evaluación y conservación, al Laboratorio Nacional de Royas y Otras Enfermedades de Cereales (LANAREC) ubicado en El Campo Experimental Valle de México (CEVAMEX), perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP).

Las muestras con urediniosporas de roya amarilla fueron incrementadas en la variedad Apizaco por considerarse susceptible a moderadamente susceptible a roya amarilla. Para ello, en vasos de unicel conteniendo una mezcla de tierra estéril y Peat Moss en una proporción 60:40, fueron sembradas 12 semillas por vaso. Cinco días después de la siembra todas las plántulas fueron tratadas con ácido maleíco (MH30^®) para regular su crecimiento. Cada muestra fue inoculada en un vaso con plántulas de Apizaco de ocho días de edad, suspendiendo las urediniosporas en aceite mineral (Sotrol^® 170; Chevron Phillips Chemical Company, The Woodlands, Texas, Estados Unidos), y asperjando sobre la lámina de las hojas, con un atomizador conectado a un compresor eléctrico. Las plántulas inoculadas se dejaron secar por un período de 20 min posteriormente se pasaron a una cámara bioclimática con temperaturas de 4 °C y rocío al 100% durante 24 horas. Después de ese período las plántulas inoculadas se trasladaron a un invernadero cuya temperatura fluctuó entre 18-20 °C. Cada vaso conteniendo las plántulas se colocaron en jaulas de plástico individuales. A los 15 días después de la inoculación se colectaron de cada aislamiento urediniosporas aisladas, usando colectores especiales conectados a un compresor eléctrico y almacenándolas en cápsulas de gelatina. Con la finalidad de obtener inoculo suficiente y puro, las urediniosporas colectadas se incrementaron nuevamente en la variedad Apizaco, siguiendo el procedimiento antes descrito.

Para la identificación de los aislamientos se utilizaron un grupo de 16 genotipos de cebada enlistados en el Cuadro 1, los cuales fueron sembrados, por grupo, en charolas de plástico de 20 × 30 × 6 cm conteniendo una mezcla de tierra estéril y Peat moss en una proporción 60:40. Durante la siembra se marcaron pequeños orificios en el sustrato de cada charola y se colocaron de 8 a 9 semillas por genotipo, originando igual número de plántulas; posteriormente, a los 15 días después de la siembra, el grupo de genotipos se inocularon individualmente con cada uno de los aislamientos (45) previamente incrementados y siguiendo la metodología descrita anteriormente para la purificación e incremento del inóculo. A los 15 días después de la inoculación se registró la reacción de los genotipos utilizando la escala del 0-9 descrita por ^{Roelfs et al. (1992}). Para la designación del aislamiento se utilizó la abreviatura MEXC que indica que es un aislamiento identificado en México en el cultivo de cebada, seguido del año y número de aislamiento registrado.

Evaluación de genotipos en plántula. En el LANAREC, bajo condiciones de invernadero (T min. 18 °C - T máx. 20 °C) se evaluó la resistencia en plántula de 15 líneas avanzadas de cebadas de dos hileras, provenientes del Programa de Mejoramiento Genético de Cebada del INIFAP-CEVAMEX y una variedad testigo (Meztli). Se sembraron los 16 genotipos en charolas de plástico, se marcaron pequeños orificios y se colocaron de 8 a 9 semillas por genotipo, posteriormente a los 13 días después de la siembra las plántulas se inocularon con una suspensión de urediniosporas de los aislamientos MEXC/21.5 y MEXC/21.9, a una concentración de 1 x 10⁶ urediniosporas mL^-1. El aislamiento MEXC/21.5 se identificó como el de menor espectro de virulencia; mientras que MEXC/21.9 fue de los más virulentos y el de mayor frecuencia. Las urediniosporas fueron suspendidas en aceite mineral (Soltrol^® 170) y asperjadas con un atomizador conectado a un compresor. Las plántulas inoculadas se colocaron en una cámara bioclimática con temperaturas de 4-7 °C por 24 horas y roció al 100%. Posteriormente se trasladaron al invernadero y después de 15 días de la inoculación se registró la respuesta a la roya amarilla en la escala del 0-9 propuesta por ^{Roelfs et al. (1992}), donde los valores de 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 se consideran como reacción de resistencia y 7, 8 y 9 reacción de susceptibilidad.

Evaluación de genotipos en campo. La evaluación en campo se realizó durante el ciclo primavera-verano del 2021 en tres localidades representativas de la zona productora de cebada de temporal de los Valles Altos de la Mesa Central de México: 1) Terrenate, Tlaxcala, ubicada a 19° 26’ 55.9” de LN y 97° 56’ 23.3” de LO y una altitud de 2 530 msnm; 2) Nanacamilpa, Tlaxcala, a 19° 30’ 8.3” LN, 98° 31’ 9.6” LO y una altura de 2 701 msnm, 3) Chapingo, Texcoco, Estado de México, a 19° 29’ 14.8” LN, 98° 53’ 49.3” LO a 2 252 msnm. El diseño experimental utilizado fue bloques completos al azar con 16 tratamientos (genotipos) y cuatro repeticiones, dando un total de 64 unidades experimentales o parcelas por cada localidad. La unidad experimental fue de cuatro surcos de tres metros de largo y espaciados a 30 cm, que corresponde a una superficie de 3.6 m², considerada como parcela útil. Se evaluaron 15 líneas avanzadas (tres de ellas en proceso de descripción para su registro oficial ante el Servicio Nacional de Inspección y Certificación de Semillas - SNICS) y la variedad Meztli, de reciente introducción a México. Todo el germoplasma fue de dos hileras. La incidencia de la roya amarilla se presentó de forma natural a partir de la etapa de embuche (etapa de desarrollo 41-49; ^{Zadoks et al., 1974}) ya que las tres localidades presentan condiciones climáticas favorables para el desarrollo de la enfermedad, como temperaturas de frías a templadas (5 a 18 °C) y la formación de rocío.

Se registraron las variables: 1) Días a espigamiento (DE), días transcurridos desde la siembra hasta el momento en que el 50% de las plantas presentaban espigas visibles; 2) Días a madurez fisiológica (DM), días transcurridos desde la siembra hasta el momento en que el pedúnculo de la espiga cambió a un color amarillo paja; 3) Altura de planta (AP), altura en centímetros desde la superficie del suelo hasta la punta de la espiguilla terminal de la espiga principal o superior; 4) Rendimiento de grano (REND), peso de grano producido por todas las espigas de cada parcela útil, registrado en gramos, la cual posteriormente se transformó en kg ha^-1; 5) Peso hectolítrico (PH), peso del grano por unidad de volumen (kg hL^-1); 6) Severidad final de la enfermedad (SFE), nivel máximo del área foliar dañada, registrada en porcentaje y utilizando la escala sugerida por ^{Roelfs et al. (1992}). Con las lecturas de severidad (tres) tomadas en intervalos de tiempo se calculó el Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad (ABCPE) utilizando la ecuación descrita por ^{Bjarko y Line (1988}). Los datos de las variables obtenidas en las tres localidades fueron analizados estadísticamente de manera conjunta con el programa SAS 9.3 (SAS, 2016) y se realizaron comparaciones de medias para las variables en estudio mediante la prueba DMS (p≤ 0.01).

Resultados y discusión

Virulencia de P. striiformis f. sp. hordei. En el ciclo primavera-verano del 2021 se identificaron nueve aislamientos de P. striiformis f. sp. hordei en siete localidades de Tlaxcala, Estado de México e Hidalgo. Dichos aislamientos se muestran en el Cuadro 2, donde se observa que el MEXC/21.9, MEXC/21.16 y MEXC/21.23 fueron los de mayor virulencia, mientras que el MEXC/21.5 fue el menos virulento. Todos los aislamientos fueron avirulentos en los genotipos Heils Franken, Esperanza, Alina, Armida, Doña Josefa, Maravilla y Brennus; y virulentos a ABI Growler.

En el Cuadro 3 se presentan los aislamientos identificados por localidad y estado, donde se observa que la mayor diversidad (cuatro aislamientos) se identificó en Terrenate, Tlax. En esta localidad también se identificó el aislamiento MEXC/21.9 con mayor frecuencia, 27%, y asimismo se identificó en Nanacamilpa, Tlax. Por otra parte, el aislamiento MEXC/21.18 se identificó en Tlaxco, Tlax. y Apan, Hgo. Cabe mencionar que estas localidades se encuentran dentro de las zonas de mayor importancia en producción de cebada de los estados de Hidalgo y Tlaxcala.

La roya amarilla de la cebada (Figura 1) no existía en México hasta antes de 1986 y de acuerdo con ^{Calhoun et al. (1988}) y ^{Sandoval et al. (1999}), durante el verano de 1987, esta enfermedad se detectó en los Valles Altos de la Mesa Central de México, para 1988 causó pérdidas de rendimiento hasta del 50% como lo indicaron ^{González et al. (2021}). Dicha epidemia fue adjudicada principalmente a la raza 24 que se caracterizó por su virulencia para el genotipo Heils Franken como lo indicaron ^{Stubbs (1985}) y ^{Line (2002}) y que posee los genes de resistencia Rps4 y RpsHF. Ninguno de los nueve aislamientos identificados mostró virulencia para Heils Franken; sin embargo, comparten cierta similitud con la raza 23 previamente identificada por Stubbs (1985) y posteriormente reportada por ^{Marshall y Sutton (1995}), dicha raza es avirulenta a Heils Franken. Los resultados de virulencia/avirulencia observados en Heils Franken sugieren que los aislamientos identificados en este estudio podrían derivarse de la raza 23 y no de la raza 24.

Figura 1 Síntomas de P. striiformis f. sp. hordei en plántula y planta adulta en genotipos de cebada. A. Plantas adultas con reacción de susceptibilidad; B. Plantas adultas con reacción de resistencia; C. Uredias en hoja de planta adulta; D. Uredias y telias en granos y aristas; E. Telias en vaina; F. Respuesta de susceptibilidad en estado de plántula; G. Uredias en hoja de plántula. 

Las variedades de cebada Esperanza, Alina, Armida y Maravilla fueron resistentes a todos los aislamientos identificados. Esmeralda solo fue susceptible a los aislamientos MEXC/21.16 y MEXC/21.23. Dicha variedad ha sido moderadamente resistente a roya amarilla desde su liberación, y fue descrita por ^{Zamora et al. (1997}) como la primera variedad desarrollada en México para condiciones de temporal que tiene tolerancia a la roya amarilla y que hasta el 2015 ocupaba el 80% de la superficie sembrada de cebada de temporal. No obstante ^{González et al. (2021}) indican que el INIFAP ha obtenido grandes logros en la liberación de variedades, siendo las más importantes Esperanza y Esmeralda que por su resistencia a roya lineal o amarilla, permitieron la producción de cebada para cervecería tanto en condiciones de riego como de temporal; logrando la autosuficiencia nacional en el año 2000.

Respuesta en plántula y planta adulta. Bajo condiciones controladas en laboratorio e invernadero, se evaluó la respuesta en plántula de 15 líneas y una variedad testigo de cebada de dos hileras. En el Cuadro 4 se presenta la respuesta en plántula a dos aislamientos, MEXC/21.9 con su fórmula de virulencia/avirulencia: Apizaco, Puebla, Kaputar, Guanajuato, ABI Growler, ABI Voyager, AC Metcalfe, Meztli/Heils Franken, Esmeralda, Esperanza, Alina, Armida, Doña Josefa, Maravilla, Brennus; y MEXC/21.5: Apizaco, ABI Growler/Heils Franken, Puebla, Kaputar, Esmeralda, Guanajuato, Esperanza, Alina, Armida, Doña Josefa, ABI Voyager, AC Metcalfe, Maravilla, Brennus, Meztli. Las líneas L-3, L-4, L-5 y la variedad Meztli fueron susceptibles a los dos aislamientos evaluados, y la L-10 solamente fue susceptible al aislamiento MEXC/21.5. En el 80% de las líneas evaluadas se observó respuesta de resistencia con lecturas de 0 a 6 de infección según la escala de ^{Roelfs et al. (1992}).

En cuanto a resistencia en planta adulta en el Cuadro 4, se indican el porcentaje de severidad final observado en las localidades de Terrenate y Nanacamilpa, Tlaxcala y Chapingo, Texcoco, Estado de México. La mayoría de las líneas evaluadas mostró niveles satisfactorios de resistencia en planta adulta con lecturas de 0 a 10% de infección. Las líneas 3 y 4 fueron moderadamente resistentes a moderadamente susceptibles, con lecturas del 15 a 20% de infección. La variedad testigo (Meztli) fue moderadamente resistente a moderadamente susceptible (5 a 15% de severidad), cabe indicar que es una variedad de reciente introducción para su cultivo en las dos condiciones de siembra en México (riego y temporal) y es probable que comparta similitud con el germoplasma introducido de otros países (EUA y Canadá) por los consorcios cerveceros por lo cual sus niveles de resistencia observados no son satisfactorios. En las líneas candidatas a liberación (Frida “s” y Alexia “s”) se observó buena resistencia a P. striiformis f. sp. hordei en plántula, así como también en planta adulta en todas las localidades de evaluación.

Con base a la respuesta de resistencia a roya amarilla observada en los genotipos evaluados, se puede inferir que en el programada de cebada predomina la resistencia monogénica sobre la resistencia poligénica, ya que de las 15 líneas evaluadas, 10 fueron resistentes en plántula y planta adulta; no obstante, también se identificaron tres líneas (L-3, L-4 y L-5) que fueron susceptibles en plántula mientras que en planta adulta fueron de moderadamente resistentes a moderadamente susceptibles, con lo que se infiere que poseen resistencia de tipo poligénica. Los resultados mostrados coinciden con lo reportado por ^{Sandoval et al. (1999}; ²⁰⁰⁷); ^{Niks (2014}); ^{Gangwar et al. (2018}) quienes indican que en el patosistema cebada-roya amarilla, se han identificado dos tipos de resistencia; la resistencia en plántula, la cual esta correlacionada en planta adulta y la resistencia parcial, la cual se caracteriza por presentar plántulas susceptibles, pero porcentajes bajos de área foliar dañada en planta adulta.

Comportamiento agronómico. En cebada como en otros cultivos, las variables agronómicas son los principales factores a considerar cuando se genera y libera una variedad, por lo que evaluar el comportamiento agronómico en campo permite observar el potencial de cada genotipo. En el Cuadro 5 se presenta la comparación de medias por localidad de las variables días a espigamiento (DE), días a madurez (DM), altura de planta (AP), peso hectolítrico (PH) y rendimiento de grano (REND) de las 15 líneas y variedad testigo. Para DE la localidad de Chapingo fue en donde los genotipos expresaron mayor precocidad. Para DM en Nanacamilpa y Terrenate fueron estadísticamente iguales; en ambas localidades el ciclo de cultivo fue más largo a diferencia de Chapingo donde en promedio la madurez fisiológica del germoplasma fue de 105 días. Resultados similares fueron reportados por ^{González et al. (2016}), quienes indican que las condiciones específicas de cada ambiente determinan la duración del ciclo de cultivo. En cuanto a AP, en la localidad de Terrenate se observaron los mayores portes de planta y los menores en Nanacamilpa (Cuadro 5). Para PH los valores más altos para esta variable fueron obtenidos en Chapingo (61.06 kg hL^-1), seguido de Nanacamilpa (59.49 kg hL^-1). Únicamente la localidad de Terrenate registró un valor promedio de PH inferior a lo establecido en la norma para la comercialización de los productos. De acuerdo con ^{González et al. (2013)}, el peso hectolítrico (PH) es un factor de calidad que se le relaciona con la textura del endospermo o con el contenido de proteína del grano, siendo un parámetro muy importante en la industrialización de la cebada maltera debido a que sus valores influyen directamente en el rendimiento y calidad de los productos terminados. El rendimiento de grano (REND) fue superior en Chapingo con 5,282 kg ha^-1; para las localidades de Nanacamilpa y Terrenate no se observaron diferencias estadísticas significativas en el rendimiento obtenido. En general, el mejor comportamiento agronómico fue observado en Chapingo, Estado de México, y aunque en esta localidad se registraron los mejores valores de PH y rendimiento, estas variables no están correlacionadas. Sin embargo, se prefieren genotipos con valores altos para estas dos variables.

En el Cuadro 6 se presenta la comparación de medias para los 16 genotipos incluida la variedad testigo, donde se observan diferencias estadísticas entre ellas para todas las variables evaluadas. Para días a espigamiento (DE) la línea 13 (L-13) fue la más precoz (49 días), mientras que la más tardía (71) fue la variedad testigo Meztli. Para días a madurez (DM) la L-3 y L-13 fueron las más precoces, mientras que Meztli (testigo), fue la más tardía; el ciclo tardío mostrado en el testigo es común observarlo en los materiales introducidos (^{Rodríguez et al., 2021}) y recomendados por los consorcios cerveceros. Es probable que la causa principal sea debido a que no fueron generados para las condiciones de cultivo presentes en México. Para altura de planta (AP), la L-3 fue la de mayor porte (99 cm), el resto de los genotipos tuvieron portes menores con relación a esta línea, siendo la línea L-13 el genotipo con la menor altura de planta. De acuerdo con ^{González et al. (2016}) estos portes de planta son considerados intermedias y adecuadas para el cultivo de cebada, alturas con mayor porte que las aquí registradas favorecen problemas de acame y posteriores problemas durante la cosecha. La L-13 fue la que en promedio registró el peso hectolítrico (PH) más alto (63.12 kg hL^-1), seguido de la L-11, mientras que el menor valor se observó en Meztli (53.71 kg hL^-1), siendo 10 unidades inferior al valor obtenido en la mejor línea lo cual representa un 17% de superioridad de la línea experimental sobre el testigo. Los valores de PH registrados muestran una gran variación entre el germoplasma evaluado como respuesta del genotipo al ambiente de producción (^{Kangor et al., 2017}; González et al., 2016). En cuanto al rendimiento de grano, seis líneas superaron en rendimiento al testigo comercial. Los rendimientos más altos se observaron en L-8 (6,097 kg ha^-1), L-9 (5,776 kg ha^-1) y L-14 (5,706 kg ha^-1) las cuales fueron estadísticamente iguales. La línea L-8 rindió 1,200 kg más que el testigo Meztli lo que equivalió a un 24.5% más de ganancia. En cuanto a Severidad Final de la Enfermedad (SFE) y Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad (ABCPE), Meztli fue la variedad en donde se observaron los valores más altos (145), seguido de la L-3 y L-1 para estas variables (Cuadro 6).

En general la mayoría de las líneas evaluadas mostraron adecuadas características agronómicas y físicas, de las cuales, el rendimiento de grano y el peso hectolítrico, son los parámetros de mayor importancia para elegir a los genotipos que podrán ser liberados. De acuerdo con la norma NMX-FF-043-SCFI-2003 las cebadas de dos hileras para ser consideradas en la industrialización cervecera, su valor mínimo será de 58 kg hL^-1. De las 15 líneas evaluadas, 12 de ellas en promedio presentaron valores de peso hectolítrico conforme a la norma establecida.

En México se han reportado pocos estudios que se enfoquen a evaluar la variabilidad patogénica de P. striiformis en cebada; sin embargo, en los últimos ciclos agrícolas la roya amarilla se está presentando con mayor frecuencia en el país, como lo mencionan ^{Rodríguez et al. (2019}). En otros países como EUA, ^{Chen y Penman (2005}), reportan la presencia 15 razas fisiológicas que identificaron en 2004 en California y Oregón. Posteriormente ^{Wang y Chen (2012}) detectaron la presencia de 11 razas fisiológicas en 2008 y cinco en 2009 en Oregón y Washington. ^{Wang y Chen (2019}) indicaron la presencia de 12 razas principalmente identificada en el oeste de EUA. Estudios realizados por ^{Prashar et al. (2014}) reportaron para la India cinco patotipos; mientras que ^{Safavi et al. (2017}) identificaron la presencia de 10 razas fisiológicas en Irán. Recientemente ^{Bail et al. (2022}), mencionan que en Estados Unidos la diversidad patogénica de P. striiformis fue en aumento del 2010 al 2017 observándose cambios rápidos de virulencia de un año a otro. Ante estas evidencias, es imprescindible monitorear la variabilidad patogénica P. striiformis lo que permitirá conocer en tiempo cualquier cambio de virulencia siendo una estrategia importante a considerar en los programas de mejoramiento como lo indican ^{Rodríguez et al. (2010}) quienes al analizar la virulencia de la roya amarilla en el cultivo de trigo resaltan la importancia en la identificación de razas fisiológicas del patógeno siendo una herramienta útil en el mejoramiento genético, que permite crear y liberar nuevas variedades con las combinaciones genéticas más efectivas para el control de la enfermedad.

Por su resistencia en campo a P. striiformis f. sp. hordei, bajo incidencia natural, las líneas L-10, L-11 y L-15 fueron identificadas como inmunes; sin embargo, en general, los niveles de resistencia observados en la mayoría de las líneas de cebada de dos hileras son satisfactorios. Dichos resultados coinciden con lo reportado por ^{Xi et al. (2013}) quienes indicaron que, al evaluar germoplasma de cebada de dos y seis hileras, encontraron un mayor número de genotipos de dos hileras con resistencia a roya amarilla. No obstante, en el programa de mejoramiento de cebada del INIFAP en los últimos años el germoplasma obtenido se ha probado bajo infección natural en campo e invernadero con aislamientos seleccionados. Dicha estrategia ha permitido seleccionar líneas con niveles de resistencia altos, esta estrategia utilizada en México también se aplica en los programas de mejoramiento de cebada de diversos países, entre ellos EUA, como lo menciona ^{Chen (2007}). Por otra parte, ^{Brown et al. (2001}) indicaron que la resistencia genética es un medio efectivo, práctico y económico para el manejo de la roya amarilla de la cebada. ^{Ambula et al. (2022}) también indicaron que la resistencia genética es una alternativa efectiva si se incorporan en las nuevas variedades los genotipos resistentes, permitiendo mejorar la productividad del cultivo de cebada al reducir los efectos de las royas. Además, ^{Czembor et al. (2022}) mencionan que la resistencia en planta adulta (RPA) es potencialmente más durable y efectiva para el control de enfermedades en cebada evitando pérdidas en el rendimiento.

Considerando la variabilidad de P. striiformis f. sp. hordei presente en México y el nivel de resistencia que poseen las variedades y líneas, es importante continuar con la evaluación y rotación de germoplasma en ambientes contrastantes para evitar la disminución en la resistencia ya obtenida en los programas de mejoramiento.

Conclusiones

Se identificaron nueve aislamientos de roya amarilla de la cebada en el ciclo P-V/2021. No se identificó virulencia para el genotipo Heils Franken por lo cual no se detectó la raza 24. Las líneas de cebada de dos hileras en su mayoría mostraron resistencia monogénica. La línea L-8, fue la de mayor potencial de rendimiento y resistente a roya amarilla en plántula y planta adulta. Alexia “s” es la línea candidata con inmunidad a roya amarilla. La evaluación de la resistencia en invernadero y en campo bajo ambientes contrastantes es una estrategia viable para la identificación de germoplasma resistente a roya amarilla en cebada que permitirá liberar variedades con resistencia genética.