Colecta de muestras, aislamiento y caracterización morfológica de cepas

Se colectaron plantas de jitomate con síntomas de marchitez vascular en cuatro sitios, dos del poblado de Maneadero y dos del poblado de San Quintín del municipio de Ensenada, Baja California. En total, se colectaron 60 plantas de jitomate con diferentes niveles de síntomas de marchitez vascular. De San Quintín Este, se obtuvieron cinco muestras de la variedad tipo Cherry de un cultivo establecido a cielo abierto. De San Quintín Norte, se obtuvieron diez plantas de cultivo en invernadero establecidos en bolsas, cinco tipo Cherry Zebra y cinco tipo Fresa. De Maneadero Sur, se muestrearon tres invernaderos con cultivos establecidos en suelo, en el primero se tomaron dos plantas del tipo Cherry y tres del tipo Heirloom; en el segundo, cinco muestras del tipo Heirloom, y en el tercero cinco muestras, una de la variedad G5, tres de la variedad RG-871 y una de la variedad TC. Finalmente, en Maneadero Norte se tomaron muestras de 30 plantas tipo Cherry establecidos a cielo abierto.

Las muestras previamente etiquetadas, fueron depositadas en bolsas de polietileno e inmediatamente trasladadas al laboratorio de Fitopatología del Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada (CICESE) para su procesamiento. Las plantas se lavaron con agua corriente, se secaron con toallas de papel y en el tallo, a aproximadamente 10 cm de altura de la corona se realizaron tres cortes transversales y se obtuvieron trozos de tejido sintomático. Se sumergieron en alcohol al 75% y se flamearon rápidamente. Posteriormente, con la ayuda de una navaja esterilizada al calor, se cortaron rebanadas de alrededor de 0.5 cm y se colocaron sobre medio de cultivo agar papa-dextrosa (PDA), suplementado con cloranfenicol (15 μg mL^-1) y las cajas se incubaron en la oscuridad a 25 ± 2 °C. Para la obtención de cultivos puros del crecimiento fúngico observado, alrededor de siete días después de la siembra, se transfirieron puntas de hifas a medio PDA y su identidad putativa se hizo por observación morfológica. A partir de éstos cultivos primarios se obtuvieron cepas monospóricas, que se mantuvieron en glicerol a -20 °C hasta su utilización.

Los aislamientos fúngicos se cultivaron en PDA y agar-clavel (CLA) (Fisher et al., 1982), dos de los medios estándar utilizados en la identificación de las especies de Fusarium (^{Leslie y Summerell, 2008}). Las cajas se mantuvieron a 27 °C en total obscuridad, de acuerdo a lo recomendado para su identificación. Después de 15 días se analizó la morfología y pigmentación de la colonia en PDA y la producción de esporodoquios, esclerocios, las estructuras de reproducción y las macroconidias en medio CLA usando un microscopio estereoscopio Olympus SZX12 y un microscopio invertido Axiovert 200 Zeiss^®.

Caracterización molecular de razas de F. Oxysporum f. Sp lycopersici

Para la extracción de ADN, las cepas se cultivaron en papa dextrosa líquido en agitación a 27 °C durante cuatro días. El micelio se recuperó por filtración, se congeló y liofilizó en tubos de microcentrifuga de 2 ml y se pulverizó usando varillas de vidrio de punta aguzada. El ADN genómico se obtuvo empleando el método de CTAB al 3% y al final se ajustó a 50 μg mL^-1.

Para la identificación de las razas de Fol se mezclaron dos pares de oligonucleótidos reportados previamente (^{Hirano y Arie, 2006}) para realizar un PCR múltiple. El par sp13-f (5’-GTCAGTCCATTGGCTCTCTC-3´) y sp13-r (5’-TCCTTGACACCATCACAGAG-3’) amplifican un fragmento de 445 pb del gen de una exopoligalacturonasa (pgx4) en las razas 1 y 3 pero no en la raza 2; el par sp23-f (5’-CCTCTTGTCTTTGTCTCACGA-3’) y sp23-r (5’-GCAACAGGTCGTGGGGAAAA-3’) fue diseñado en el sitio de deleción de dos nucleótidos (nt 259-260) en el gen de una endopoligalacturonasa (pg1) y amplifica un fragmento de 518 pb en las razas 2 y 3, pero no en la raza 1. En los aislados de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici estos oligonucleótidos no amplifican ningún fragmento (^{Hirano y Arie, 2006}). Después de probar varias condiciones de amplificación combinado los oligonucleótidos, La mezcla de reacción usada consistió en 1X buffer (Axygen), 0.2 μg mL^-1de BSA, 0.2 mM de dNTPs, 2.5 mM de MgCl₂, 0.4 µM de cada uno de los cuatro oligonucleótidos, 0.1 U μg^-1 de Taq polimerasa (5 U, Axygen) y 50 ng de ADN en un volumen final de 25 µL. La amplificación consistió en un ciclo de 94 °C por 1 min, seguido de 45 ciclos de 94 °C por 1 min, 61 °C por 1 min y 72 °C por 1 min, y una extensión final a 72 °C por 10 min, usando un termociclador BioRad T100. Los productos se evaluaron en electroforesis en gel de agarosa al 1% y se fotografiaron utilizando un fotodocumentador Quantity One de BioRad. El control positivo fue ADN extraído de Fol raza 1 y Fol raza 2, proporcionadas amablemente por el Dr. Raymundo García del Centro de Investigación en Alimentos y Desarrollo (CIAD), unidad Culiacán.

Una vez analizados los productos de PCR, y para confirmar que el fragmento amplificado correspondía a la secuencia esperada, se seleccionaron al azar cinco aislados de las razas determinadas. Los productos amplificados seleccionados se cortaron del gel y se purificaron utilizando el kit DNA clean y concentrator (Zymo Research) siguiendo las instrucciones del fabricante y los fragmentos generados fueron enviados a secuenciar a Eton Bioscience Inc. (San Diego, California). Una vez obtenidas las secuencias, éstas se compararon utilizando el algoritmo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Se recuperaron secuencias de los fragmentos de pgx4 y pg1 y todas se alinearon utilizando el programa BioEdit v7.2.3 (copyright (c) 1997-2013, Tom Hall).

Para confirmar que los aislados obtenidos y analizados con la PCR múltiple pertenecían a F. oxysporum, se seleccionaron algunos de ellos y se amplificó por PCR un fragmento de alrededor de 700 pb de la región del TEF1-α, usando los oligonucleótidos EF-1 y EF-2 (^{O’Donnell et al., 1998}). Usados anteriormente para diferenciar entre especies de Fusarium (^{Lievens et al., 2009}). La reacción de PCR fue similar a la usada para amplificar los genes de poligalacturonasas, excepto que se disminuyó la concentración a 1.5 mM de MgCl₂. La amplificación constó de una desnaturalización inicial de 94 °C por 3 min, seguido de 40 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 61.5 °C, 1 min a 72 °C y una extensión final de 10 min a 72 °C. Los fragmentos se evaluaron por electroforesis en gel de agarosa, se purificaron y secuenciaron como se describió de manera previa. Para el análisis comparativo de las secuencias, se accedió al banco de datos Fusarium-ID (http://isolate.fusariumdb.org) y al del NCBI, usando el algoritmo de BLAST. Algunas secuencias que mostraron máxima similitud con las obtenidas en este trabajo se obtuvieron del banco de datos, y todas se alinearon usando el programa BioEdit v7.2.3. Finalmente, se obtuvo el filograma utilizando el programa MEGAX (^{Kumar et al., 2018}).

Identificación de razas de Fol con el uso de variedades diferenciales

Para confirmar la identificación de las razas determinadas por PCR múltiple, se utilizaron cuatro genotipos de jitomate; Bonny Best (sin resistencia), Manapal (resistente a Fol raza 1), Walter (resistente Fol raza 2) e I₃R₃ (resistente a Fol raza 3) (^{Ascencio-Álvarez et al., 2008}).

Las semillas de cada variedad, se sembraron en charolas de polietileno de 72 cavidades en una mezcla 2:1 de Peat moss-perlita. Después de 30 días, se trasplantaron en macetas de polietileno de 1 L. A los 21 días del trasplante, seis plantas de cada variedad se inocularon con uno de cinco aislados seleccionados (los mismos usados en el análisis de secuenciación), agregando 10 mL de una suspensión de 1X10^-7 conidios mL^-1 a dos centímetros del tallo (^{Baysal et al., 2009}). Como controles positivos se usaron las cepas Fol razas 1 y 2 y como control negativo 10 mL de agua. Las plantas se mantuvieron en condiciones de invernadero a temperatura variable 36±16 °C, distribuidas en un diseño completamente al azar. La evaluación de daños se realizó diario hasta la observación de síntomas en las cepas control (aproximadamente 15 días después de la inoculación), basándose en la escala arbitraria de daño propuesta previamente (^{Vakalounakis y Fragkiadakis, 1999}), donde: 0 = planta sin síntomas, 1 = planta con marchitez leve o similar a la falta de agua, 2 = planta similar a grado 1 + hojas amarillas o secas, en menos del 50% del follaje, 3 = planta similar a escala 1 + hojas amarillas o secas en un 50% o más del follaje y 4 = plantas completamente marchitas. Cada una de las escalas representa los siguientes porcentajes de daño (0%, 25%, 50%, 75% y 100%). Las plantas que presentaron un porcentaje de marchitez vascular del 20% o menos fueron catalogadas como resistentes a las cepas inoculadas.

Evaluación de la variabilidad genética de Fusarium spp. por polimorfismos de ADN amplificados al azar

Para determinar la variabilidad inter e intraespecífica entre los aislados, se utilizó la técnica de amplificación al azar de ADN polimórfico (RAPD) (^{Assigbetse et al., 1994}; ^{Jiménez et al., 2001}; ^{Luna-Paez et al., 2004}). El tamaño y número de fragmentos generados en las cepas tipo Fol raza 1 y Fol raza 2, se determinó mediante el uso de los oligonucleótidos universales: OPA-01 (5’-CAGGCCCTTC-3’), OPA-03 (5’-AGTCAGCCAC-3’), OPA-05 (5´-AGGGGTCTTG-3´), OPA-11 (5´-CAATCGCCGT -3´), OPA-15 (5’-TTCCGAACCC-3’), OPA16 (5’-AGCCAGCGAA-3’), y OPA 17 (5’-GACCGCTTGT-3’) (Operon Technologies Inc). La mezcla de reacción consistió en 0.75 mM de Taq master Mix (Mercury, Cat# 790005), 25 ng de ADN y 0.1 mM de uno de los oligonucleótidos en un volumen final de 25 μL. Las condiciones para la amplificación fueron, 94 °C por 2 min; seguida de 35 ciclos de 94 °C por un min; 36 °C por 1 min y 72 °C por 1.5 min, y una extensión final de 10 min a 72 °C. Los fragmentos amplificados se analizaron en geles de agarosa al 1.5% y su tamaño se determinó con el programa Quantity one (1D- Analysis Software) usando como referencia un marcador de peso molecular de 100 bp. Con base en los resultados, se eligieron los oligonucleótidos que mostraron patrones diferentes de bandeo de los amplicones obtenidos de cada raza y se usaron para la tipificación de las cepas obtenidas en este estudio.

Caracterización morfológica de los aislados fúngicos

En medio PDA, los aislados mostraron cuatro tipos de morfología colonial, aquí denominados A, B, C y D. Los aislados en el grupo A (Voip-1 a Voip-5) presentaron micelio algodonoso, forma irregular con coloración blanca y centro violeta en el anverso y reverso (Figura 1A). Los aislados del grupo B (Voip2 a Voip4, Voip7, Voip10, Voip12, Voip13, Voip23, Voip25, Voip26 y Voip28), presentaron micelio algodonoso, borde filamentoso con coloración violeta tenue y la presencia de esporodoquios amarillos o incoloros (Figura 1B y 1E). Los aislados del grupo C (RG-2, RG-4, RE-2, RE-4, SO-4, SO-5, SO-8, SO-9, SO-11, SO-13, Voip6, Voip8, Voip9, Voip11, Voip14 a Voip22, Voip24 y Voip27), presentaron micelio algodonoso abundante con forma filamentosa y borde circular con coloración violeta tenue en el anverso y blanco a ligeramente violeta en el reverso (Figura 1C). Finalmente, los aislados en el grupo D (RG-3, RE-3, SO-2, SO-7 y SO-15) presentaron micelio algodonoso, forma y bordes filamentosos con coloración blanca a crema en el anverso y crema en el reverso y la presencia de esporodoquios amarillos o incoloros y estructuras semejantes a esclerocios (Figura 1D y 1F).

Figura 1 Características de aislados de Fusarium oxysporum f. sp lycopersici obtenidos de jitomate. Colonias de grupos representativos A) Voip5, B) Voip23, C) Voip14, D) SO-15. E) esporodoquios, F) esclerocios observados en algunas colonias. Micrografías de macroconidios (G-K) y falsas cabezas (L-P) observados en los aislados de los cuatro grupos morfológicos de Fusarium y en F. solani. G y L) Voip5, H y M) Voip23, I y N) Voip14, J y O I) SO-15 E K y P) SO-7. 

En medio de cultivo CLA, a excepción del aislado SO-7, todos presentaron estructuras características de F. oxysporum (^{Leslie y Summerell, 2008}), entre otros: macroconidios (Figuras 1G - 1J), microconidios (Figura 1G), monofiálides (Figura 1M), estructuras conidiógenas (falsas cabezas) (Figuras 1L a 1O).

Identificación molecular de razas de Fol

Los fragmentos generados por PCR múltiple usando los pares de oligonucleótidos sp13 y sp23, indicaron la presencia de Fol raza 1 y Fol raza 3 en Baja California. De acuerdo a este análisis, 36 aislados de un total de 45, correspondieron a Fol raza 1, presente en las cuatro áreas muestreadas; siete a Fol raza 3, y de los dos restantes (SO-2 y SO-11) no se amplificaron fragmentos con ninguno de los pares de oligonucleótidos utilizados (Figura 2).

Para comparar los resultados, se secuenciaron los fragmentos amplificados con el par de oligonucleótidos sp13 de pgx4 de los aislados Voip4, Voip6, Voip8, Voip9 y Voip14, identificados como Fol raza 1 y los aislados RG-3, RE-2, SO-13 y SO-15, identificados como Fol raza 3. Al comparar las secuencias obtenidas de pgx4 con la base de datos de NCBI, todos los aislados mostraron 99% de similitud con la secuencia AB256797.1 (^{Hirano y Arie, 2006}), lo que confirmó que corresponden a Fol raza 1. Únicamente en el aislado SO-13 (raza 3), se identificó la presencia de polimorfismos nucleotídicos en las posiciones 64 y 65 con la secuencia AB256797.1, con una G sustituyendo A. Por otra parte, la comparación de secuencias de los fragmentos amplificados con el par de oligonucleótidos sp23 de pg1 de las cepas identificadas como raza 3, RG-3, RE-2, SO-13 y SO-15, poseen una T en lugar de C en la posición nucleotídica 342 y además no presentan los nucleótidos A y T en los sitios 54 y 66, que las identificarían como raza 3 y mostraron 99% de similitud con la secuencia AB256794.1, perteneciente a un aislado de F. oxysporum f. sp. tulipae y con AB256778.1 de F. oxysporum f. sp. melonis. RE-3, presentó una G en el sitio 342, diferenciándose del resto de los aislados.

Figura 2 Fragmentos generados por los pares de oligonucleótidos sp13 (que amplifica un fragmento de 445 pb del gen pgx4, en las razas 1 y 3) y sp23 (que amplifica un fragmento de 518 pb del gen pg1, en las razas 2 y 3) en los aislados de Fusarium oxysporum. Se obtuvo un fragmento de unas 445 pb, en los aislados RG-2, RE-4, SO-4, SO-7, SO-8 y SO-9. Mientras que los aislados RG-3, RG-4, RE-2, RE-3, SO-5, SO 13 y SO15, generaron 2 fragmentos de unas 445 y 518 pb, aprox. Los aislados SO-2 y SO-11, no mostraron fragmentos. 

Amplificación del factor de elongación (TEF1α)

Con base en el análisis de la PCR múltiple, se amplificó el TEF1α de los aislados: Voip4, Voip6, Voip8, Voip9, Voip14, SO-7 (Fol raza 1), RG-3, RE-2, SO-13, SO-15 (Fol raza 3), SO-2 y SO-11 (no identificados por la PCR múltiple). De la mayoría, se amplificaron fragmentos de alrededor de 700 pb excepto de SO-11 (alrededor de 650 pb) y en SO-2 en donde no se obtuvo amplicón, pese a que la integridad del ADN fue verificada y se intentó la PCR varias veces. Al analizar las secuencias amplificadas del TEF1-α, se verificó que todos los aislados, excepto SO-7 pertenecen a la especie F. oxysporum. El aislado SO-7 se agrupo con las secuencias de F. solani (KT357542.1 y KT357549.1) (Figura 3).

Identificación de razas utilizando cultivares diferenciales de jitomate

La prueba de patogenicidad de los aislados de Fol en plantas de jitomate mostró una susceptibilidad de las variedades de jitomate acorde a la variedad y aislamiento del hongo. En el cultivar Bonny Best, todos los aislados causaron marchitez. Voip9 fue el que causó mayor daño (41%), seguido de Voip14, RE-2, SO-13 y Fol R2 (38%); Voip-8, RG-E, SO-11 y Fol R1 (32%) y Voip4 y RE-3 (29%). Los que menor daño ocasionaron (25%) fueron los aislados Voip6, SO-15 y SO-7. Las plantas no inoculadas no mostraron ningún daño (Figura 4a).

En Manapal, el aislado Voip9 fue el que causó mayor daño (54%), seguido de SO-15 (41%); Voip14, RG-13, RE-2 y SO-13 y Fol R2 (33%); Fol R1 (29%); RE-3 y SO-7 (25%), Voip4, Voip6, Voip8 y SO-11 y las plantas control (9%) (Figura 4b).

Figura 3 Filograma utilizando el método Neighbor-Joining basado en secuencias de la región TEF1-α con 500 réplicas. Hubo un total de 591 posiciones en el conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X (^{Kumar et al., 2018}). El árbol está dibujado a escala, con la longitud de las ramas en las mismas unidades que las distancias evolutivas utilizadas para inferir el árbol filogenético. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de máxima probabilidad compuesta (Maximum Composite Likelihood). 

En Walter, todos los aislados produjeron arriba del 10% de marchitez vascular, excepto Fol R2, que ocasiono 9%; Voip8, Voip9 y Fol R1 (45%); Voip14, RE-3, SO-7 (41%); RG-3 y SO-15, (37%); RE-2 y SO-11 (33%); SO-13, Voip4 y Voip6, menos del 20% (Figura 4c). En I3R3, el aislado Fol R1 fue el que mayor marchitez produjo (58%); seguido de Voip8, Voip14 y SO-13 (53%); RG-3 (50%); RE-2 (45%), Voip9 (41%), Vop6 y RE-2 (38%); SO-15 (32%), SO-11 (25%), Voip4 (19%), SO-7 (8%) y RE-3 (3%) y el control (8%) (Figura 4d). El Cuadro 2, muestra un resumen de los resultados obtenidos en las pruebas para la identificación de razas de acuerdo a comparaciones entre la presencia de fragmentos generados por los sets de oligonucleótidos raza-específicos, las secuencias obtenidas y las pruebas in planta.

Figura 4 Porcentaje de marchitez ocasionado por los aislados: Voip4, Voip6, Voip8, Voip9, Voip14, RG-3, RE-2, RE-3, SO- 13, SO-15, SO-7 y SO-11, en cuatro cultivares de jitomate diferenciales a) Bonny Best, susceptible a las tres razas, b) Manapal, resistente a la raza 1, c) Walter, resistente a las razas 1 y 2 y d) I3R3, resistente a la raza 3. 

Variabilidad genética de aislados de Fol (RAPD)

Los oligonucleótidos OPA-01, OPA-15, OPA-16 y OPA-17 no generaron ningún fragmento en Fol razas1 y 2, por lo que fueron descartados para el análisis de la variabilidad entre ambas razas usadas como tipo. El número y tamaños aproximados de los fragmentos observados con OPA-03, fueron ocho en Fol raza 1 de 1430, 519, 691, 752, 988, 1380, 1413 y 1926 pb y cuatro en Fol raza 2 de 519, 717, 1000 y 1430 pb. Con el iniciador OPA-05, se observaron tres fragmentos de alrededor de 790, 954 y 1430 pb en Fol raza 1, y cuatro en Fol raza 2 de 636, 790, 954 y 1616 pb. Por último, con el iniciador OPA-11, se obtuvieron 4 fragmentos en Fol raza 1 con tamaños aproximados de 664, 776, 1273 y 1660 pb y en Fol raza 2, cinco fragmentos de 430, 607, 725, 1284 y 1637 pb (Figura 5A).

En la evaluación de los aislados obtenidos en esta investigación, usando el oligonucleótido OPA-05, no se encontraron patrones específicos (datos no mostrados), por lo que se descartó su uso. Con OPA-11, se obtuvieron siete patrones de bandas con los siguientes tamaños aproximados. El primer patrón mostró cuatro fragmentos de 664, 776, 1273 y 1660 pb y fue observado en veintinueve aislados obtenidos identificados como Fol raza 1 en las pruebas anteriores (Voip1-Voip16, Voip18-Voip26, Voip28-Voip30 y SO-11). El segundo patrón observado en la cepa Voip15 fue de dos fragmentos de 730 y 1266 bp. El tercero con cuatro fragmentos de 508, 1343, 1730 y 2134, se observó en los aislados RG-3 y SO-4. El cuarto de 745 bp en RG-4. El quinto con 500, 775, 871, 1211, 1343, 1645 y 2175 bp en RE-2, RE-3 y RE-4. El sexto con cinco fragmentos de 742, 1160, 1312, 1632 y 2202 y el séptimo con tres fragmentos de 886, 1166 y 1525 en SO-9. No se observó un patrón de bandeo especifico usando OPA-11 en las cepas que fueron identificadas como raza 3 usando la amplificación de genes de poligalacturonasas (RG-3, RE-2, SO-13 y SO-15) (Figura 5B).

Figura 5 Patrones de bandas observados en el análisis RAPD en cepas de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol). A. Patrones de bandas observados en las cepas tipo de Fol razas 1 y 2, generados por los oligonucleótidos universales OPA-03, OPA-05 y OPA-11. B. Fragmentos generados por el oligonucleótido OPA-11, que muestran siete patrones de bandas en los aislados de Fusarium obtenidos de jitomate. Los aislados Voip8-Voip24 presentaron el mismo patrón de bandas, al igual que los RE-2, RE-3 y RE-4, los otros cinco presentaron diferente número y tamaño de fragmentos.