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1. Introducción
Los nanogeles térmicamente sensibles (NG) exhiben una cambio en su transición de hinchamiento y contracción a una temperaturas de transición critica baja (LCST) [1]. Una alternativa de gran utilidad es poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm) es el polímero termosensible más ampliamente estudiado con una LCST de 32 °C [2, 3]. Esta temperatura es cercana a la temperatura corporal por lo que los nanogeles y microgeles de NIPAAm tienen un gran potencial en aplicaciones biomédicas como liberación controlada de fármacos [4, 5], y portadores de genes [6, 7], así como materiales de terapia dirigida a patologías donde se genera un cambio en la temperatura [8-12] y materiales embólicos de vasos sanguíneos [13].
Una preocupación con el monómero y los polímeros de NIPAAm es su toxicidad. Se han realizado varios estudios para evaluar la toxicidad de NIPAAm y sus productos poliméricos en cultivos celulares [14]. Por ejemplo, Wadajkar et. al demostraron que los monómeros de NIPAAm son citotóxicos, mientras que las nanopartículas de PNIPAAm son compatibles a una concentración de 5 mg/mL o inferior para fibroblastos, células de músculo liso y células endoteliales, incluso cuando queda una pequeña cantidad del monómero en el material [15]. En cuanto a los estudios de toxicidad en animales, Malonne et al. estudiaron la toxicidad después de la administración oral de copolímeros de PNIPAAm a ratones; no encontraron toxicidad a 400 mg/kg de peso corporal [16]. En otro estudio, se evaluó el efecto de inyecciones intravítreas de PNIPAAm como adhesivo tisular en conejo. Los investigadores encontraron que PNIPAAm no era tóxico en este estudio [17].
La capacidad de administrar fármacos y material genético en las células depende de la carga superficial del nanomaterial. Se ha establecido que las nanopartículas catiónicas tienen la capacidad de penetrar en las células, presentando una mayor eficacia para la obtención de imágenes, la transferencia de genes y la administración de fármacos [18].
Las nanopartículas tienen la condición de mejorar la estabilidad y la solubilidad de las cargas encapsuladas, fomentando el transporte a través de membranas y prolongando los tiempos de circulación para aumentar la seguridad y la eficacia [19, 20].
Sin embargo, las nanopartículas con carga positiva presentan mayor citotoxicidad que las nanopartículas con carga negativa [21].
Como se observó anteriormente, la mayoría de las evaluaciones de toxicidad se realizan en cultivos celulares. Surgen preocupaciones sobre el número limitado de líneas celulares estudiadas en las evaluaciones de toxicidad considerando las diferencias en los mecanismos de absorción del material, la sensibilidad celular, etc. Es, por lo tanto, necesario utilizar un modelo pluricelular para una mejor predicción de la toxicidad de los nanomateriales en humanos.
Las diferencias entre especies no son el único factor que limita la traducción clínica, también la diversidad entre pacientes puede limitar el éxito de los nanomedicamentos [22].
Muchas de las primeras iteraciones de NP no pudieron superar estas barreras biológicas para la entrega, pero los diseños de NP más recientes han utilizado avances en estrategias de síntesis controlada para incorporar estructuras complejas, fracciones biosensibles y agentes para mejorar la entrega [23, 24].
Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un nematodo de vida libre de 1 mm de largo que fue postulado como modelo animal en 1965 por Sydney Brenner [25]. Existe una superposición sustancial entre C. elegans y los seres humanos con respecto a los genes y las vías bioquímicas [26]. Los análisis bioinformáticos sugieren que entre el 38% y el 40% de los genes del gusano son homólogos a los humanos [27]. En entornos de laboratorio, C. elegans ingiere Escherichia coli OP50 de la dieta bombeándolos a la boca y concentrándolos en la faringe antes de pasar al intestino [28, 29]. C. elegans es un organismo muy simple. Consta de cinco parejas de cromosomas autosómicos y una pareja de cromosomas sexuales, siendo su tamaño de 100 millones de pares de bases de nucleótidos; veinte veces mayor que el genoma de E. coli y sobre 1/30 parte del genoma humano [30, 31]. El hermafrodita adulto tiene exactamente 959 células somáticas [32].
Los factores genéticos y ambientales que afectan a C. elegans son similares a aquellos que afectan a humanos, principalmente estrés oxidativo, restricción calórica y reducción en la masa muscular (sarcopenia) [33].
El reflejo de bombeo permanente en la faringe de C. elegans se ha aplicado para estudiar la digestión, la absorción y la bioactividad de las nanoemulsiones [34, 35].
En este trabajo, estudiamos el efecto de la ingestión por parte de C. elegans de NG copoliméricos de NIPAAm y el monómero básico DEAEM preparado por polimerización en emulsión sin jabón utilizando una forma polimerizable de polietilenglicol como estabilizador (polietilenglicol monometil metacrilato de éter) [36, 37]. Se utilizaron dos iniciadores para la síntesis de los NG, aniónico y catiónico.
2. Materiales y métodos
2.1 Materiales
N-isopropilacrilamida (NIPAAm) (Tokio Chemical Industry CO., LTD) se purificó mediante recristalización en hexano, 2-(dietilamino) metacrilato de etilo (DEAEM) se purificó mediante destilación a presión reducida. El dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA) se purificó pasándolo a través de una columna rellena con resina eliminadora de hidroquinona y metilhidroquinona (ALDRICH). Diclorhidrato de 2,2-azobis-(2-metilpropionamina) (AIBA), persulfato de amonio (APS) (ALDRICH), polietilenglicol-metil éter metacrilato (PEGMA) con un peso de 2.080 g/mol. El metacrilato de fluoresceína fue sintetizado en el laboratorio de Biofarmacia UABC. C. elegans, E. coli OP50 fueron proporcionados por la Universidad de Navarra España.
2.2 Síntesis de nanogeles
Se sintetizaron NG NIPAAm:PEGMA:DEAEM 47:41:12 w% utilizando EGDMA como reticulante (3% mol con respecto a NIPAAm). Se disolvió un total de 500 mg de monómero en 50 ml de agua MiliQ. La solución se desgasificó con nitrógeno durante 30 min y posteriormente se calentó a 85 °C durante 30 minutos. Se añadieron AIBA o APS (2% mol con respecto a NIPAAm). Se preparó un lote de nanogeles que contenían metacrilamida de fluoresceína (0,5% mol con respecto a NIPAAm) usando APS como iniciador. En todos los casos, la reacción se llevó a cabo durante 45 minutos. Después de eso, los nanogeles se sometieron a diálisis contra agua para su purificación durante 5 días. El diámetro hidrodinámico, Dh, se obtuvo por dispersión de luz dinámica (DLS) usando el Zetasizer NanoNS (DTS1060; instrumental Malvern). El efecto de la temperatura sobre el tamaño de los nanogeles se evaluó de 20 a 50 °C.
2.3 Microscopia electrónica de barrido de emisión de campo
Las imágenes de microscopia electrónica de barrido de emisión de campo (FESEM) de las MG se adquirieron con un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo, modelo JSM-7800F Prime. Con este fin, se esparció una gota de dispersión de micropartículas (0,4% en peso) sobre la superficie de una rejilla de cobre recubierta de carbón de malla 400. Se añadieron dos gotas de acetato de uranilo (2% en peso) a la rejilla. Las muestras se secaron en horno de vacío a 22°C durante 24 h. Las muestras secas se sujetaron a una varilla de muestras FESEM, se insertaron en la cámara de muestras y se observaron a 25 kV.
2.4 Preparación de placas con medios de crecimiento de nematodos (NGM).
Se preparó 1 L de agar para nematodos, con 3 g de NaCl, 27 g de agar bacteriológico, 2,5 g de pepsina, 965 mL de agua, 1g de CaCl2. Los medios se esterilizaron en autoclave. Posteriormente se adicionó 1 mL de colesterol (5 mg/mL), 1 g MgSO4, KH2PO4 (1 M) 25 mL, nistatina 10 mL (5 mg/mL), ampicilina 1 mL (5 mg/mL).
2.4 Colocación de los NG
En el fondo de las placas se colocaron 250 uL de NG, se colocaron 3.75 mL de agar preparado, se dejó secar y se agregaron 250 uL de NG. El estudio se realizó por triplicado. Por otro lado, se preparó una placa de control sin NG.
2.5 Colocación de C. elegans en placas
Para las pruebas de toxicidad, los nematodos se sincronizaron con la etapa de desarrollo L1 utilizando el método de sincronización de cloro. Después de la eclosión de los gusanos (mínimo de 19 horas), se centrifugaron a 1400 rpm durante 4 minutos y se eliminó el sobrenadante. Se tomaron 10 µL del sedimento en un portaobjetos para observar al microscopio y contar los gusanos. Se colocó el volumen de sedimento necesario para tener un mínimo de 400 nematodos por caja Petri. Las placas se resguardaron a 20 °C durante 1-2 días hasta su desarrollo, sin que las larvas superaran el estadio L4.
2.6 Ingestión de los nanogeles por C. elegans
Para determinar si las nanopartículas fueron ingeridas por gusanos, se cultivaron nematodos N2 sincronizados en placas NGM bacterianas OP50 con NG marcados con fluoresceína. Después del tratamiento durante 2 h, los nematodos se lavaron tres veces durante 30 s en medio M9 y luego se colocaron en portaobjetos preparados con almohadillas de agar al 2% frescas. Los nematodos fueron anestesiados con azida de sodio (1%).
La presencia de NG marcados con fluoresceína ingeridos por los gusanos se visualizó en un microscopio de fluorescencia (Axioimager M1, Zeiss, Alemania) con una cámara acoplada (Axiocam Icc3, Zeiss, Alemania) y una fuente fluorescente (HBO 100, Zeiss, Alemania). Las imágenes fueron capturadas con el software ZEN (Zeiss, Alemania).
2.7 Tinción rojo Nilo
Los gusanos L4 cultivados en diferentes condiciones (concentraciones de nanogeles) se recolectaron y lavaron con Triton X-100 al 0,01% en solución salina tamponada con fosfato (PBST) y se fijaron en isopropanol al 40% durante 3 min. La tinción se realizó mediante la adición de una solución de rojo Nilo (3 µg/ml) y la incubación (30 min) con balanceo suave a temperatura ambiente en la oscuridad. Los gusanos se lavaron en PBST y se montaron en una almohadilla de agarosa al 2% para visualización microscópica.
Se capturaron imágenes fluorescentes de gusanos teñidos con rojo Nilo en un estereomicroscopio Nikon SMZ18 (Nikon Instruments Inc., Japón) equipado con un sistema de epifluorescencia y una cámara digital a color refrigerada DS-FI1C. Las imágenes se tomaron bajo un filtro GFP (Ex 480-500, DM 505; BA 535-550). El análisis de imágenes se realizó utilizando el programa ImageJ.
2.9 Estudio de tamaño de C. elegans
Al microscopio (Nikon SMZ18 Research Stereomicroscope) se tomaron al menos 30 fotos por placa para estudio luego de realizar la tinción correspondiente descrita anteriormente, luego de tomar las fotos se guardaron para estudiar el volumen y contenido de grasa del nematodo con el software ImagenJ-Win64.
2.10 Análisis estadístico
Todos los cálculos fueron analizados con IBM SPSS. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en condiciones similares. Los resultados se expresaron como la media ± DE. Se consideraron diferencias estadísticamente significativas cuando el valor de p fue inferior a 0,05.
Se calcularon las medias y los errores estándar. Para las comparaciones de grupos en el estudio in vivo, los datos se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de una prueba de comparación múltiple de Tukey-Kremer con el software estadístico NCSSTM 11 (NCSS, LCC. Kaysville, EE. UU.). EE.UU). La diferencia se consideró significativa cuando p <0,05 o p <0,001.
3. Resultados
3.1 Síntesis y caracterización de nanogeles
Los nanogeles se produjeron de manera eficiente con rendimientos superiores al 80%. La Figura 1. muestra la distribución de tamaño de los nanogeles iniciados con AIBA (A) y la distribución de tamaño iniciados con APS (B). Se observa un diámetro hidrodinámico (Dh) de 150 nm, así como un índice de polidisperción de (PDI = 0,198) para los NG iniciado con AIBA, mientras que para el NG iniciado con APS se obtiene un Dh de 160 nm y un (PDI = 0,194) y una temperatura de transición similar de 36 °C. En las dos síntesis el tamaño de los nanogeles son óptimas ya que permite la evaluación de toxicidad en los nematodos, el índice de polidisperción es el adecuado nos dice que los NG se encuentras distribuidos de una forma uniforme. Los tamaños nanométricos de los NG se corroboran con microscopia electrónica de barrido de emisión de campo (FESEM) que se muestran en la (Figura 2).
Figura 1 Distribución de tamaños de nanopartículas a 25 °C iniciadas con AIBA (A) o APS (B). Sensibilidad a la temperatura de los NGs con AIBA (A1) y APS (B1).
Figura 2 Imágenes de microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FESEM) de nanogeles iniciados con AIBA (A) y APS (B).
La sensibilidad a la temperatura se presenta en la Figura 1. de 20 °C a 50 °C con una transición discontinua y un LCST así como su sensibilidad a la temperatura en agua AIBA (A1) y APS (B1). Ambos nanogeles presentan una temperatura de transición (LCST) de 36 °C ya conocida y estudiada pues por estudios anterior se sabe que NIPAAm tiene una LCST de 32 °C cercana a la temperatura corporal, y la incorporación de monómeros hidrofílicos incrementa la LCST.
3.2 Ingestión de los nanogeles por C. elegans
En la Figura 3, se muestra la ubicación de los NGs marcados con fluoresceína en todo el tracto digestivo de C. elegans, lo que demuestra la ingestión de materiales por parte del nematodo, teñido con rojo Nilo para observar el interior del nematodo.
3.3 Estudio de toxicidad.
En la Figura 4 se presentan los datos de toxicidad en C. elegans, se observó que en la gráfica (A) que los nematodos que ingirieron NG son más pequeños comparados con el control (NGM), pero también se observó que tienen mayor cantidad de grasa, esto nos lleva a los resultados de la gráfica (B) donde evaluamos la relación grasa/volumen que nos indica que los nematodos son de tamaño pequeño, pero tienen un mayor volumen, esto comparando con el control, con lo que podemos concluir los nanogeles tienen efecto en el tamaño del nematos teniendo un nematodo más pequeños pero aumentando su volumen generando un gusano más gordos.
4. Discusiones
En microscopía de fluorescencia se observa que los nanogeles se distribuyen por todo el sistema gastrointestinal y digestivo del nematodo, lo que nos demuestra que C. elegans ingiere los biomateriales, ya que estos tienen un tamaño adecuado (120 a 180 nm) para poder ser ingerido por este tipo de nematodo, En estudios de toxicidad se concluyó que los nanogeles que se iniciaron con AIBA en comparación con APS tienen un mayor impacto en la grasa del nematodo, pero menor impacto en el volumen. La relación grasa-volumen indica que los nematodos alimentados con los nanogeles son pequeños, pero con gran cantidad de grasa, esto comparado con el control indica que los gusanos alimentados con los nanogeles son más grandes y gordos.
Los resultados indican que los nanogeles tienen cierto grado de toxicidad, lo que corrobora los resultados obtenidos en estudios previos usando cultivos celulares [5].
Se sabe que los materiales catiónicos interactúan con las membranas celulares (cargadas negativamente) provocando la ruptura de la membrana, seguida de la entrada de Ca2+. La elevación del Ca2+ intracelular induce la desgranulación y el estrés oxidativo. La consecuencia de estos efectos es la citotoxicidad y la muerte celular [38].
Evaluar la toxicidad de nanomateriales sensibles utilizando el sistema C. elegans es una alternativa sólida para el desarrollo de biomateriales considerando que se utiliza un organismo vivo multicelular donde se puede estudiar el efecto sobre su funcionamiento y desarrollo.
5. Conclusiones
El nematodo C. elegans demostró ser un modelo viable para evaluar la toxicidad de nanopartículas responsivas. Esto resulta en una alternativa robusta para el desarrollo de biomateriales considerando que se utiliza un organismo vivo multicelular donde se puede estudiar el efecto sobre su funcionamiento y desarrollo, en trabajos a futuros se plantea realizar estudios in vitro en las mimas condiciones y con los mismos materiales que este trabajo y poder comparar los efectos en los dos modelos, así como también se plantea poder realizar estudios de cargado y liberación de fármacos para futuros estudios in vivo.
6. Reconocimiento de autoría
Alondra Montañez Rios: Conceptualización; Metodología; Investigación; Escritura- Borrador original; Escritura: revisión y edición. Aracely Serrano Medina: Escritura (Revisión y Edición), Recursos, Supervisión, administración del proyecto, gestión de fondos. Juan M. Irache: Metodología, validación, administración del proyecto, recursos, supervisión. Ana L. Martínez López: Metodología, Validación, administración del proyecto, recursos. Ignacio Rivero: Metodología, Validación, recursos. Cornejo-Bravo: Conceptualización, Análisis Formal, Visualización, Escritura (revisión y edición).
