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Introducción
El avance tecnológico en la reproducción ovina ha favorecido el entendimiento de la fisiología ovárica, lo cual permite modificar los protocolos de sincronización de estro para ser eficientes, cuidando el bienestar animal, así como el efecto que genera en el ambiente el uso de estos protocolos (Gonzalez-Bulnes et al. 2020). Entre las prácticas de sincronización de estro, recientemente resalta el uso de dispositivos CIDR que se utilizan por periodos cortos (5 a 7 días), que presentan una respuesta reproductiva similar a los tratamientos convencionales (12 a 14 días) (Martinez-Ros et al. 2018). Esta tendencia parte del principio de que el aporte exógeno de progesterona (P4) actúa sobre el recambio folicular, causando la regresión de los folículos dependientes de gonadotropinas; permitiendo sincronizar una nueva onda folicular (Año-Perello et al. 2020), lo que hace posible la liberación de un ovocito más saludable (Menchaca y Rubianes 2004).
Además, existe evidencia de que al elevar la concentración sérica de P4 mediante un agente exógeno, durante la primera oleada folicular, en tratamientos de duración cortos, se puede mejorar la competencia del ovocito para la escisión y desarrollo embrionario (Menchaca et al. 2018); así como incrementar la tasa de fertilización del ovocito y mejorar las características embrionarias (Cuadro et al. 2018). Esto da la pauta para sugerir que diferentes concentraciones iniciales de P4 endógena, más la aplicación exógena en protocolos de sincronización, pueden influir sobre la respuesta a este recambio folicular y características antes mencionadas. En estos tratamientos se recomienda la aplicación de eCG para asegurar la presentación de estros y ovulación en un rango de tiempo delimitado, así como el incremento de la tasa ovulatoria (Martinez-Ros y Gonzalez-Bulnes 2020). Esto nos genera la idea de que una dosis alta de eCG puede incrementar el desarrollo folicular por el efecto FSH/LH con el que cuenta, permitiendo la síntesis de estradiol (E2) por parte de los folículos y la manifestación de la conducta estral. El E2 además ejerce una retroalimentación positiva en GnRH del hipotálamo, lo que ocasiona el pulso preovulatorio por parte de LH (Correa-Aguado et al. 2022).
Es sabido que, durante la luteinización y la presencia del CL, se incrementa el flujo sanguíneo en el ovario, lo que aporta nutrientes, hormonas y factores de crecimiento, que benefician el completo desarrollo de los ovocitos (Argudo et al. 2020). Esto presenta un efecto para obtener ovocitos de mejor calidad, lo cual puede que influir positivamente sobre la fertilidad, por ello es que en el presente trabajo, no se eliminó directamente el CL al finalizar los protocolos de sincronización.
De acuerdo con las tendencias expuestas se buscan alternativas a los tratamientos hormonales que permitan ser eficientes; además, no existe evidencia directa que respalde nuestras hipótesis, por lo que evaluaremos la eficiencia sobre variables reproductivas, de protocolos de sincronización de estro durante periodos cortos y convencionales (CIDR 6 y 11 días), al iniciar el tratamiento con o sin la presencia de un CL funcional, y la aplicación únicamente de eCG como promotor de la presentación de estro y ovulación.
Materiales y métodos
Localización
El experimento se llevó a cabo en la unidad ovina del Colegio de Postgraduados, ubicada en Montecillo, Estado de México, a 98° 53’ LO y 19°29’ LN, a 2 250 msnm. El clima es templado subhúmedo con una temperatura promedio de 12 a 18°C (García 2004).
Animales experimentales
Durante época reproductiva, se utilizaron 80 ovejas multíparas, de la cruza Katahdin x Dorset, con una condición corporal 3 en un rango de 1 a 5. Previamente, las ovejas recibieron manejo profiláctico; así mismo, se comprobó la ausencia de gestación mediante ultrasonografía. Las ovejas estuvieron estabuladas, recibieron agua y minerales a libre acceso, y una dieta que cubriera sus requerimientos nutricionales de proteína cruda (9.1%) y energía metabolizable (2.1 Mcal kg-1) según lo recomendado por el NRC (2007). El manejo de los animales se realizó de acuerdo a las normas establecidas por el Comité de Bienestar Animal del Colegio de Postgraduados.
Sincronización previa
Se contemplaron 100 ovejas inicialmente, 25 por tratamiento, para poder eliminar a las que no presenten estro a la sincronización mediante la aplicación de dos dosis de prostaglandina F2α (PGF2α, 125 μg, Celosil®), con un intervalo de 8 días; esta práctica nos ayudó a regular el tiempo de vida del CL (Figura 1), considerando que después de la segunda aplicación de PGF2α las ovejas que presentaron estro continúan con su fase lútea.
Figura 1 Tratamientos de sincronización de estro. T1 = 6 días sin cuerpo lúteo funcional (6d SCL). T2 = 6 días con cuerpo lúteo funcional (6d CL). T3 = 11 días sin cuerpo lúteo funcional (11d SCL). T4 = 11 días con cuerpo lúteo funcional (11d CL). CIDR- dispositivo controlado de liberación interna. eCG- Gonadotropina Coriónica equina. PG-administración prostaglandina F2α.
Tratamientos y sincronización de estros
De las ovejas pre-sincronizadas, se eligieron 80, las cuales se asignaron aleatoriamente en cuatro tratamientos (n = 20), bajo arreglo factorial 2 x 2 consistente en dos periodos de duración de la sincronización del estro (6 y 11 días), y ovejas con CL inmaduro o funcional, antes de iniciar el protocolo de sincronización (lo cual se corroboró mediante un muestreo de P4 antes de iniciar la sincronización). Se colocó un dispositivo CIDR® Ovis a todas las ovejas, el cual permaneció el tiempo indicado, según la duración del periodo de sincronización de cada tratamiento, al retiro recibieron 400 UI de eCG (Gonactive®) (Figura 1).
Detección de estros
La detección de estro después de la presincronización y la sincronización, se inició 24 h posterior a la aplicación de PGF2α o retiro del CIDR respectivamente; esta se registró durante 3 días consecutivos, en intervalos de 6 h. La detección de estro durante la presincronización se realizó con apoyo de machos con mandil y para ambos casos se consideraba en estro a las ovejas que presentaban signos de receptividad y que permanecían inmóviles a la monta. El inicio de estro se registró al recibir su primera monta después de la sincronización.
Monta natural y retorno a estro
Se realizaron 3 servicios por hembra, utilizando diferentes machos fértiles, iniciando a los primeros signos del estro y dos montas subsecuentes con 12 h de separación. Posteriormente, se revisó actividad estrual 14 a 17 días después del inicio de estro, mediante la misma metodología.
Diagnóstico de gestación y prolificidad
Mediante un transductor lineal prostático (7.5 MHz) se realizó ecografía con un equipo CHISON, Eco 6 a los 30 y 60 días después del primer servicio. Durante el último tercio de la gestación las ovejas fueron alojadas en corraletas individuales 10 días previos a la fecha probable de parto, para registrar cada uno de los partos y las crías nacidas por oveja.
Muestreo y análisis hormonal
Los días de muestreo sanguíneo para analizar P4 se presentan en la Figura 1, los muestreos se distribuyeron de tal manera que pudiéramos cuantificar la concentración inicial de P4 para cada tratamiento (CL inmaduro o funcional), 4 h después del inserto y posteriormente durante el periodo de sincronización (6, 3 y 1 día antes del retiro de CIDR), para evaluar el aporte exógeno según la duración de cada tratamiento de sincronización; este análisis continuó hasta el día de presentación del estro sincronizado y el inicio de la siguiente fase lútea; los muestreos de E2 se realizaron desde 3 días antes del retiro de CIDR hasta 24 h después del día de presentación de estro (Figura 1), con la finalidad de observar si se llevaba a cabo la retroalimentación esteroidal, y registrar información acerca de lo que sucedía a nivel ovárico. Se colectaron muestras de 12 ovejas de cada tratamiento mediante punción de la vena yugular (5 mL) a las 08:00 h, las cuales fueron centrifugadas a 1500 g a 4 °C por 20 min; posteriormente, el suero sanguíneo se separó y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. Se utilizó radioinmunoensayo (RIA) para caracterizar la concentración de P4 en suero con el kit comercial PROGESTERONE [I-125] RIA®. El E2 se caracterizó por inmunoensayo de quimioluminiscencia (ELISA) con el kit comercial DRG Estradiol CLIA®.
Análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar con arreglo factorial 2 x 2, el primer factor fue la duración del tratamiento de sincronización del estro (6 y 11 días) y el segundo factor fue la presencia de CL inmaduro o funcional al iniciar el tratamiento. Se utilizaron estadísticos no paramétricos para las variables que no presentaron normalidad (Shapiro-Wilk). Los resultados se analizaron con una prueba de χ2 mediante Kruskal-Wallis en las variables presencia de estro y tasa de gestación, se compararon las medias con prueba Nemenyi. Se realizó un análisis de mediciones repetidas a través del tiempo para la concentración de P4 y E2; y se calcularon las medias de mínimos cuadrados mediante Tukey-Kramer. El nivel de significancia que se consideró fue α = 0.05. Se utilizó el paquete estadístico SAS 9.0 para Windows 6.2.
Resultados y discusión
En la Tabla 1 se presenta la respuesta de las variables reproductivas, para cada tratamiento. Existieron discrepancias en la presentación de estro (p < 0.05) entre grupos experimentales debido a la duración del tratamiento para sincronizar estro, los protocolos convencionales exhibieron el 100% de estro comparados con los porcentajes obtenidos en los tratamientos cortos (5 a 35%). Los datos observados en protocolos de sincronización de estro a 11 días concuerdan con lo reportado por Uriol et al. (2019) al implementar protocolos convencionales durante 12-14 días. La baja presencia de estros en los tratamientos de sincronización a 6 días obtenidos en la presente investigación, difieren a lo reportado por Uriol et al. (2019) y Martínez-Ros et al. (2018) quienes reportaron 100% de estros al aplicar CIDR (5 y 6 días), aunado a 400 UI de eCG y 5 mg de PGF2α, al retiro del CIDR. La diferencia en los resultados, pudo deberse a la falta de aplicación de PGF2α al retiro del dispositivo, para observar si había beneficios por la alta concentración de P4 o la existencia de un CL en alguno de los ovarios. La aplicación o síntesis de PGF2a induce la regresión del CL (Correa-Aguado et al. 2022), lo que provocará el descenso de la P4. La probable presencia de un CL al término de los protocolos cortos de la presente investigación, inhibió la presentación de estro; al respecto Luna-Palomera et al. (2023) reportan el éxito de los protocolos cortos de sincronización si se garantiza los niveles adecuados de P4, presentación de estro y fertilidad.
Tabla 1 Medias y error estándar de las variables reproductivas en ovejas.
| 6d SCL | 6d CL | 11d SCL | 11d CL | |
|---|---|---|---|---|
| Presencia de estro (%) | 35 (7/20)b | 5 (1/20)c | 100 (20/20)a | 100 (20/20)a |
| Inicio de estro (h)1 | 24.9 ± 0.9 | 30 | 31.2 ± 2.6 | 33.3 ± 3.4 |
| Retorno a estro (%) | 5 | 0 | 0 | 10 |
| Gestación (%)2 | 30 (6/20)b | 0c | 100 (20/20)a | 85 (17/20)a |
| Prolificidad3 | 2.2 | 0 | 1.9 | 1.9 |
6 d SCL = 6 días sin cuerpo lúteo funcional. 6d CL = 6 días con cuerpo lúteo funcional. 11 d SCL = 11 días sin cuerpo lúteo funcional. 11 d CL = 11 días con cuerpo lúteo funcional. 1 Tiempo referido al retiro del CIDR. 2Basado en los perfiles de P4 en suero y ultrasonografía en el día 30. 3 Número de corderos nacidos por oveja parida. abc Valores con distinta literal entre columnas son diferentes (P < 0,05). Entre paréntesis se presenta el número de animales en cada caso.
La presentación de estros influyó directamente sobre la respuesta del porcentaje de gestación, mostrando diferencias (p < 0.05) entre los tratamientos de 11 y 6 días, el mayor porcentaje de gestación fue para los tratamientos de sincronización de estro largos. Los porcentajes de gestación obtenidos con tratamientos durante 11 días, fueron ligeramente mayores a los de Molina-Mendoza et al. (2005) quienes reportan 83.3 y 77.8% con y sin presencia de CL respectivamente, utilizando monta natural, ellos sincronizaron el estro durante 12 días y se aseguraron de contar con la presencia o ausencia de un CL a lo largo del periodo de sincronización; por lo tanto, la diferencia en concentración de P4 endógena cuando hay o no un CL, al iniciar un protocolo convencional, no afectan la fertilidad. Los porcentajes de gestación obtenidos en tratamientos cortos del presente experimento, fueron incluso menores a los de Luna-Palomera et al. (2023) quienes reportan hasta 79% de gestación al utilizar inseminación artificial, después de la sincronización durante 7 días con CIDR y 150 UI eCG más 125 μg de cloprostenol al momento del retiro, seguramente la diferencia en los resultados se debió a que no se presentó la luteólisis al no aplicar PGF2α en el presente experimento. No obstante, además de la aplicación de PGF2α, otros factores pueden interactuar en la respuesta reproductiva de protocolos cortos, al respecto Swelum et al. (2018) reportan tasas de gestación de 55 a 65%, utilizando CIDR nuevos y con seis días de uso aunado a 300 UI de eCG al retirar el CIDR, con tratamientos de sincronización de estro durante 6 días.
No existieron diferencias entre grupos para el inicio de estro (p > 0.05), ya que se observaron resultados que coinciden con los obtenidos por Uriol et al. (2019), con un inicio de estro a las 34.0 ± 5.0 y 39.2 ± 4.0 h en tratamientos convencionales y cortos (con eCG) respectivamente, sin encontrar efecto por el periodo de sincronización. Otra ventaja de utilizar dosis altas de eCG es que el índice de prolificidad puede incrementar. La prolificidad fue semejante (p > 0.05) entre los grupos que lograron gestar; lo cual coincide con otras investigaciones donde la dosis de 400 UI de eCG proporcionan valores de prolificidad de hasta 2.3 (López et al. 2021).
A pesar de que los tratamientos cortos no respondieron al estro sincronizado y se esperaba un gran porcentaje de ovejas en retorno, el efecto de los tratamientos no presentó diferencia (p > 0.05). El bajo porcentaje en los tratamientos cortos, podría estar relacionado con la vida media del CL generado por la presincronización al inicio de los tratamientos, evidencia de esto es que la concentración de P4 sigue siendo elevada días después de la presentación del estro sincronizado (Figura 2). Aunado a esto, el enriquecimiento folicular por la dosis de eCG administrada el día del retiro pudo haber tenido efecto sobre los folículos de la nueva oleada sincronizada generándose la luteinización y anovulación del folículo. En los ovarios cambios celulares y moleculares como la expresión de receptores para hormonas esteroidales o gonadotrópicas durante el crecimiento folicular contribuyen a la anovulación y la formación de quistes (Chamba-Ochoa et al. 2017).
Figura 2 Concentración de P4 en diferentes eventos fisiológicos. 6 d SCL = 6 días sin cuerpo lúteo. 6 d CL = 6 días con cuerpo lúteo. 11 d SCL = 11 días sin cuerpo lúteo. 11 d CL = 11 días con cuerpo lúteo. a b c Medias con distinta literal son diferentes (p < 0.05).
No existieron diferencias en la concentración de P4 en su interacción a través del tiempo (p > 0.05) al retirar el CIDR, sin embargo, cuando se evalúa cada uno de los factores por la interacción con el tiempo (p < 0.05) al inicio de estro y 24 h después de este, la concentración fue más alta en los protocolos cortos y con CL (Figura 2). En tratamientos convencionales el día de presentación de estro, Molina-Mendoza et al. (2005) reportan concentraciones basales (<1 ng mL-1); lo cual, no sucedió en el presente trabajo, pero tampoco afectó la respuesta de las variables reproductivas. En tratamientos de sincronización cortos, Swelum et al. (2018) reportaron similitud en las concentraciones de P4 del presente estudio durante el periodo de sincronización; sin embargo, en las siguientes 48 h al retiro del CIDR obtuvieron un descenso marcado en la concentración de P4, provocando que presentara una tasa de gestación superior a la obtenida en el tratamiento de 6 días sin CL del presente experimento. Otro estudio realizado en cabras utilizando protocolos de sincronización de estro con CIDR durante 5 días, reportan hasta un 96% de presentación de estro con concentraciones de P4 de 3.9 ± 1.7 ng mL-1 al momento del retiro de CIDR (Montes-Quiroz et al. 2018), a diferencia de nuestros tratamientos, los suyos continúan con el descenso de concentración P4 durante dos días más; lo cual pudo ocasionar la falta de respuesta en dicho tratamiento.
Existieron diferencias en la concentración de E2 (p < 0.05) por efecto de cada factor, sin interactuar con el tiempo, presentando concentraciones más altas en protocolos convencionales y sin CL. El día de presentación de estro, la concentración media de E2 del tratamiento corto con CL se mantuvo por debajo de los demás (Figura 3). No obstante, todos los tratamientos presentaron concentraciones de E2 mayores a las reportadas por Swelum et al. (2018) el día de presentación de estro, las cuales oscilan entre 2 y 2.2 pg mL-1 utilizando CIDR nuevos y reutilizados por 6 días, respectivamente. De manera natural en ovejas durante el ciclo estral, el día de presentación de estro y momento de la ovulación se presentan concentraciones de E2 que oscilan de 8.4 a 8.6 pg mL-1 (Uribe-Velásquez et al. 2011, Arsoy and Sagmanlzgil 2018). De acuerdo con esto, sería evidente esperar una respuesta de estro y ovulación en los protocolos de sincronización cortos, de la presente investigación. Sin embargo, la presencia de altas concentraciones de P4 inhiben los pulsos de GnRH a nivel hipotalámico e influye en la conducta de estro (Alvarado-García et al. 2022); entonces, la alta concentración de P4 el día 0 de los protocolos cortos evitó la conducta de estro y pudo haber reducido los pulsos de GnRH evitando el pico preovulatorio de LH. Consecuentemente, la concentración de E2 obtenida en protocolos de 6 días al presentar estro pudo ser resultado de la nueva oleada folicular sincronizada por el CIDR más el enriquecimiento folicular inducido por la eCG, pero no por un solo folículo dominante preovulatorio.
Figura 3 Concentración de E2 por factores y su interacción durante la fase folicular. 6 d SCL = 6 días sin cuerpo lúteo funcional. 6d CL = 6 días con cuerpo lúteo funcional. 11 d SCL = 11 días sin cuerpo lúteo funcional. 11 d CL = 11 días con cuerpo lúteo funcional. a b c Medias con distinta literal son diferentes (p < 0.05).
Sin importar si existe un cuerpo lúteo funcional o no, al iniciar la sincronización de estro en periodos cortos es necesario administrar prostaglandina F2α al finalizar el tratamiento, para evitar el efecto negativo del CL sobre la respuesta a estro y poder conseguir la retroalimentación esteroidal. En tratamientos convencionales la presencia o ausencia de cuerpo lúteo al iniciar la sincronización, no afecta las concentraciones de P4 y E2 el día de presentación estro, lo que permite la respuesta de las variables reproductivas.
