Procesamiento de muestras y aislamiento de Trichoderma

Para el análisis, las muestras vegetales, primeramente se lavaron cuidadosamente con abundante agua corriente; durante una hora y secaron con papel de filtro Whatman No. 4. Seguidamente, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1 % durante 30 s y posteriormente con alcohol al 70 % durante 1 min; entre cada desinfección y al final las muestras se lavaron con tres cambios de agua destilada estéril por tres minutos cada uno y secaron en papel adsorbente estéril. A continuación, las muestras se cortaron en fragmentos de 1 cm y se mezclaron para homogenizar. Por último, se seleccionaron segmentos al azar y sembraron en placas Petri de 90 mm de diámetro que contenían medio Papa Dextrosa Agar (PDA + antibiótico; cloranfenicol 0,1g L^-1) e incubaron a 28 ± 2°C a oscuridad. También, se realizó el montaje de los fragmentos en cámara húmeda; la incubación se realizó a temperatura ambiente.

Las evaluaciones se realizaron diarias hasta la aparición de estructuras reproductivas, durante 24 - 48 h.

Para la identificación, se realizaron preparaciones tomando fracciones de las estructuras fúngicas visibles (micelio y/o esporas); las cuales se visualizaron al microscopio óptico Zeiss (modelo Axiostar plus; fabricado en Alemania) con aumento de 400x. Después se realizaron varias siembras de la colonia obtenida como Trichoderma; hasta obtener un cultivo puro.

Los aislamientos y cepas de Trichoderma objeto de estudio tienen diferentes orígenes (Tabla 1).

Caracterización morfo - cultural de aislamientos de Trichoderma

La caracterización micromorfológica de los aislamientos de Trichoderma (T.) (T.13, T.17, T.75, T.78 y T.90) se realizó tomando como base los aspectos morfológicos señalados en las claves taxonómicas referidas por ^{Rifai (1969)} y ^{Gams y Bissett (1998)}: dimensiones y forma de los conidióforos, fiálides y conidios, y además la ornamentación de estos últimos; mientras que para la caracterización cultural (macroscópica) se tuvo en cuenta el color, forma y textura de las colonias.

Las colonias de Trichoderma se obtuvieron a partir de suspensiones de esporas (10 µL de una suspensión con una concentración de 10⁷ conidios.mL^-1), procedentes de cultivos puros y monospóricos de tres días de sembrados en el medio de cultivo Agar Malta (AM) (BioCen). La suspensión se depositó centralmente en placas Petri de 90 mm de diámetro, que contenían medio AM (BioCen, pH 5,5), incubadas a temperatura de 20±2°C y régimen de oscuridad constante. Las evaluaciones [características de las colonias: color, forma y textura] comenzaron a partir de las 24 h de la inoculación, hasta las 72 h; se determinaron por observación visual, documentadas mediante fotografías tomadas con una cámara digital marca Canon PowerShot ELPH 180 8x (20 MP) (Proveedor Costa Rica).

La caracterización micromorfológica de los aislamientos se realizó mediante observaciones microscópicas de las estructuras fúngicas desarrolladas en los microcultivos. Para ello, sobre portaobjetos estériles se vertió asépticamente una película fina de medio de cultivo PDA (BioCen; esterilizado a 121°C, durante 15 min y pH ajustado a 5,5) sobre la cual se sembró un fragmento pequeño de micelio de los aislamientos individualmente, proveniente de la zona de crecimiento activo en la periferia de las colonias, crecidas sobre PDA durante tres días, a 28 ± 2°C y régimen de oscuridad constante. Posteriormente, los portaobjetos sembrados se colocaron en placas Petri de 22 mm de diámetro esterilizadas y se incubaron a temperatura de 28 ± 2°C y régimen de oscuridad constante. A las 24 - 48 h de la siembra se visualizaron y midieron las estructuras fúngicas (30 conidióforos, 30 fiálides y 30 conidios), en un microscopio óptico marca Zeiss (modelo Axiostar plus; fabricado en Alemania) con aumento de 100x y 400x. Las estructuras, se documentaron como evidencia gráfica con una cámara digital marca Canon PowerShot ELPH 180 8x (20 MP) (Proveedor Costa Rica).

Variabilidad genética de aislamientos de Trichoderma

Compatibilidad vegetativa (Cv)

Para realizar el ensayo, se utilizaron cultivos de los aislados de Trichoderma del LMV del CENSA, y de las cepas de T. atroviride (IMI206040), T. viride (TV1), T. asperellum (215D) y T. harzianum (G108), conservadas en el Laboratorio de Genómica para la biodiversidad, Langebio (Guanajuato, México). Todos los aislados y cepas crecieron durante cinco días en medio PDA (Difco) e incubados a 28 ± 2°C y régimen de oscuridad constante.

Para estimar las relaciones genéticas, se realizaron confrontaciones entre los aislamientos cubanos y entre estos y las cepas de referencia de Trichoderma; (Tabla 1). Para ello, un disco de micelio de seis mm de diámetro de cada aislado y cepa de Trichoderma, se sembró frente a otro, a una distancia de 70 mm centralmente, en placas Petri de 90 mm de diámetro contentivas de medio PDA (Difco). Posteriormente, las placas se incubaron bajo oscuridad constante a 28 ± 2ºC y evaluaron a las 72 h. Las evaluaciones de las interacciones se realizaron macroscópicamente y la compatibilidad de los aislamientos se determinó, según el tipo de reacción entre ellos:

Se tomó evidencia gráfica de las interacciones, con una cámara digital marca Canon PowerShot ELPH 180 8x (20 MP) (Proveedor Costa Rica).

Variabilidad molecular de aislamientos de Trichoderma

Método de extracción del ADN

Sobre celofán colocado en el centro de placas Petri (Ø = 90 mm), contentivas de medio de cultivo PDA (Difco), se sembró centralmente un disco de cada aislamiento cubano (Tabla 1) por placa. Las placas se incubaron por 72 h a una temperatura de 28 ± 2°C y oscuridad constante. Posteriormente, el micelio se colectó con una espátula al retirar el celofán de la placa y se congeló a -20°C. Para la extracción del ADN total se usó el protocolo DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, MBH, Germany). El pellet se resuspendió en 40 - 60 μL solución amortiguadora TE 0,5X, incluido en el juego de reactivos. La calidad del ADN se verificó por electroforesis en geles de agarosa al 0,8 %, con solución amortiguadora de corrida TAE 1X (Tris base 40 mM, ácido acético 57,1 mL y EDTA 2 mM a pH 8), durante 45 min a 100V, teñido con bromuro de etidio (cinco mg.mL^-1) y visualizado en un fotodocumentador (Biorad Gel Doc XR). La concentración del ADN se determinó en un espectrofotómetro (nanodrop ND 1000), a las longitudes de onda de 260 y 280 nm, tomándose como muestras con buena calidad aquellas cuyos valores estuvieron entre 1,8 a 2 (^{Sambrook et al., 1989}). La suspensión de ADN se conservó a 4°C hasta su uso en la técnica para detectar polimorfismo entre los aislados.

Análisis RAPD

En el ensayo se usaron los aislados cubanos de Trichoderma (Tabla 1). Para la amplificación por PCR con cebadores arbitrarios, se utilizó una mezcla de reacción cuyo volumen final de 25 μL contenía: solución amortiguadora de PCR (Tris HCl 20 mM a pH 8,4, KCl 50 mM), MgCl₂ 2 mM, dNTP 0,2 mM, Taq ADN polimerasa 1U (Invitrogen), 100 ng de ADN genómico total y 0,2 μM de cada cebador: OPA02, OPA13, OPB07, OPB09, OPB10, OPE14, OPG02, OPG10, OPH03, OPH19 y OPJ20 (Firma Operon Technologies, Alameda).

Las amplificaciones se realizaron en un termociclador API Thermal Cycler; Applied Biosystems, E.U. con el siguiente programa: un ciclo de desnaturalización inicial a 94°C durante cinco min, seguido de 45 ciclos de: 94°C durante un min (desnaturalización), 30°C durante 40 s (alineamiento) y 72 °C durante dos min (extensión); con un ciclo de extensión final a 72 °C, durante 10 min.

Los fragmentos amplificados se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,5 % en TAE 1X, a 100 V durante 1,5 h. La visualización y el registro de los datos se realizaron como se describió anteriormente.

Análisis de los datos

A partir de los datos se confeccionó una matriz binaria donde se le dio el valor 1 a la presencia de la banda y 0 a la ausencia, solo se tuvieron en cuenta las bandas bien definidas. Posteriormente, se calculó el índice de similitud de Jaccard, se realizó un análisis de conglomerados por el método de UPGMA y un remuestreo tipo “bootstrap” de 10000, para estimar la robustez del dendrograma original, utilizando el paquete de software FreeTree (^{Hampl et al., 2001}).

Caracterización morfo - cultural de aislamientos de Trichoderma

Los aislamientos de Trichoderma mostraron las siguientes características generales: rápido crecimiento, circular uniforme, colonias inicialmente blanquecinas, que se tornan de color verde o azulado a las 72 h; presencia de hifas hialinas septadas, conidióforos hialinos en penachos compactados en forma piramidal, fiálides alargadas y ensanchadas en el centro, y conidios ovalados de paredes ligeramente rugosas observadas con aumento de 1000X.

Estas características ubican los aislamientos fundamentalmente en la especie: T. viride, según aspectos descritos en las claves propuestas por ^{Rifai (1969)} y ^{Gams y Bissett (1998)}.

Las características morfológicas observadas en los aislamientos coinciden con notificaciones realizadas por ^{Samuels et al. (1999)} y ^{El-Sobky et al. (2019)} en cuanto a: presencia de micelio hifal septado e hialino, conidióforo hialino, conidios generalmente ovalados, unicelulares, pequeños, formando racimos terminales, hialinos, de color verde al llegar a la maduración. Así como con las notificadas por ^{Lieckfeldt et al. (1999)}, en cuanto a la ornamentación de los conidios.

No obstante, los aislamientos entre sí, presentaron diferencias en la coloración de las colonias y la morfometría de las estructuras; evidenciándose variabilidad (Tabla 2, Figura 1A y B).

Figura 1 Caracteres morfo-culturales de los aislados de Trichoderma sp. A) Características culturales en medio AM (temperatura de 20°C y pH 5,5 a las 72 h). B) Características morfológicas (48 h). 

Figure 1: Morpho-cultural characteristics of Trichoderma isolates. A) Cultural characteristics in MA culture medium (temperature of 20°C and pH 5.5, at 72 h). B) Morphological characteristics (48 h).  

Si solo se tuviera en cuenta la variabilidad observada en los caracteres morfológicos y culturales (Tabla 2), los aislamientos se ubicarían en distintas especies, según lo descrito en la clave de ^{Gams y Bissett (1998)}. Precisamente esto es uno de los motivos de identificaciones erróneas de especies (^{Druzhinina et al., 2006}), depositadas en las bases de datos (Druzhinina y Kubicek, 2005 6B; ^{Samuels et al., 2010}).

Por esta razón, es necesario usar una taxonomía polifásica que aborde varios criterios de clasificación, que permitan identificar con mayor precisión y confiabilidad las especies del género (^{Samuels et al., 1999}; ^{Lieckfeldt et al., 1999}; ^{El-Sobky et al., 2019}; ^{Haouhach et al., 2020}).

La variabilidad se observó, además, al nivel fisiológico, donde algunos de estos aislados pudieron esporular a 35ºC, T.13 y T.90 procedentes de la región oriental y central del país, donde la mayor parte del año las temperaturas medias son elevadas (^{Infante et al., 2015}). También presentaron diferencias en la excreción de enzimas hidrolíticas, T.75 tuvo los mayores niveles de actividad quitinasa, mientras que T.13 y T.17 los mayores de glucanasa (^{González et al., 2012}). Es posible que la variabilidad detectada intraespecífica esté relacionada con su proceso evolutivo, aspecto a seguir investigando.

Variabilidad genética de los aislamientos de Trichoderma

Compatibilidad vegetativa (Cv)

Entre las cepas de referencia (Tabla 1), tomadas como patrones, se observaron reacciones de compatibilidad entre cepas de la misma especie (Figura 2A-E) e incompatibilidad entre especies diferentes (Figura 3A-C), excepto para la interacción F, G y H (Figura 2), las cuales fueron compatibles, aun siendo especies diferentes.

Figura 2 Reacciones de compatibilidad vegetativa entre las cepas de referencia. A) T. atroviride IMI206040 -T. atroviride IMI206040, B) T. virens - T. virens, C) T. asperellum 215D - T. asperellum 215D, D) T. harzianum 204 - T. harzianum 204, E) T. viride - T. viride, F) T. atroviride IMI206040 - T. asperellum 215D, G) T. asperellum 215D - T. viride, H) T. atroviride IMI206040 - T. viride. [1^er hongo (izquierda) - 2^do hongo (derecha)]. 

Figure 2: Vegetative compatibility reactions between reference strains. A) T. atroviride IMI206040 -T. atroviride IMI206040, B) T. virens - T. virens, C) T. asperellum 215D - T. asperellum 215D, D) T. harzianum 204 - T. harzianum 204, E) T. viride - T. viride, F) T. atroviride IMI206040 - T. asperellum 215D, G) T. asperellum 215D - T. viride, H) T. atroviride IMI206040 - T. viride. [1^st fungus (left) - 2^nd fungus (right)]. 

Figura 3 Reacciones de incompatibilidad entre las cepas de referencia. A) T. asperellum 215D - T. harzianum G108, B) T. atroviride IMI206040 - T. harzianum G108, C) T. viride - T. harzianum G108. [1^er hongo (izquierda) - 2^do hongo (derecha)]. 

Figure 3: Incompatibility reactions between the reference strains. A) T. asperellum 215D - T. harzianum G108, B) T. atroviride IMI206040 - T. harzianum G108, C) T. viride - T. harzianum G108. [1^st fungus (left) - 2^nd fungus (right)]. 

Esto indica, que estas especies deben estar genéticamente estrechamente relacionadas, pues la compatibilidad se logra cuando los alelos de todos los loci son idénticos (^{Galdames, 2001}). Este aspecto se tomó como criterio en las observaciones del ensayo para los enfrentamientos de las cepas de referencia con los aislados cubanos.

En las pruebas de confrontación realizadas entre los cinco aislados de Trichoderma en estudio y las cepas de referencia antes mencionadas, se observaron también reacciones de compatibilidad e incompatibilidad.

Las confrontaciones entre los aislados en estudio y las cepas de referencia T. harzianum (G108), mostraron una clara reacción de incompatibilidad (Figura 4A-E), determinada por la presencia de una barrera de inhibición [cambio de coloración en las colonias (excreción de metabolitos al medio, Figura 4A) o inhibición del crecimiento de una de las colonias, Figura 4E].

Figura 4 Reacciones de incompatibilidad vegetativa entre los aislamientos de Trichoderma y las cepas de referencia. A) T.13 - T. harzianum (G108), B) T.17 - T. harzianum (G108), C) T.75 - T. harzianum (G108), D) T.78 - T. harzianum (G108), E) T.90 - T. harzianum (G108). [1^er hongo (izquierda)- 2^do hongo (derecha)]. 

Figure 4: Vegetative incompatibility reactions between Trichoderma isolates and the reference strains. A) T.13 - T. harzianum (G108), B) T.17 - T. harzianum (G108), C) T.75 - T. harzianum (G108), D) T.78 - T. harzianum (G108), E) T.90 - T. harzianum (G108). [1^st fungus (left) - 2^nd fungus (right)]. 

^{Barcellos et al. (2011)} notificaron que la reacción de incompatibilidad se rige por un loci het, que limita la formación de heterocariones entre individuos genéticamente distintos. Es decir, si la diferencia es en uno o más loci het, las células que participan en la fusión son compartimentadas y se someten a un proceso lítico que conduce a la muerte celular. En estos casos los aislados son incompatibles; el fenómeno se identifica por la vacuolación, disolución de núcleos y generación de pigmentos, lo que se describió como barrera de reacción (^{Galdames, 2001}).

Por otra parte, en las interacciones de las cepas de T. asperellum (215D), T. atroviride (IMI206040) y T. viride (TV1) con los aislados en estudio se observaron reacciones de compatibilidad (Fig. 5A-Ñ), al igual que entre los propios aislados (Figura 6A, B y C).

Figura 5 Reacciones de compatibilidad vegetativa entre los aislamientos de Trichoderma y las cepas de referencia. A) T.13 - T. viride, B) T.17 - T. viride, C) T.75 - T. viride, D) T.78 - T. viride, E) T.90 - T. viride, F) T.13 - T. asperellum 215D, G) T.17 - T. asperellum 215D, H) T.75 - T. asperellum 215D, I) T.78 - T. asperellum 215D, J) T.90 - T. asperellum 215D, K) T.13 - T. atroviride IMI206040, L) T.17 - T. atroviride IMI206040, M) T.75 - T. atroviride IMI206040, N) T.78 - T. atroviride IMI206040, Ñ) T.90 - T. atroviride IMI206040. [1^er hongo (izquierda) - 2^do hongo (derecha)]. 

Figure 5: Vegetative compatibility reactions between Trichoderma isolates and the reference strains. A) T.13 - T. viride, B) T.17 - T. viride, C) T.75 - T. viride, D) T.78 - T. viride, E) T.90 - T. viride, F) T.13 - T. asperellum 215D, G) T.17 - T. asperellum 215D, H) T.75 - T. asperellum 215D, I) T.78 - T. asperellum 215D, J) T.90 - T. asperellum 215D, K) T.13 - T. atroviride IMI206040, L) T.17 - T. atroviride IMI206040, M) T.75 - T. atroviride IMI206040, N) T.78 - T. atroviride IMI206040, Ñ) T.90 - T. atroviride IMI206040. [1^st fungus (left) - 2^nd fungus (right)]. 

Figura 6 Reacciones de compatibilidad vegetativa entre los aislamientos de Trichoderma. A) T.75 - T.78, B) T.17 - T.90, C) T. 78 - T. 13. [1^er hongo (izquierda)- 2^do hongo (derecha)]. 

Figure 6: Vegetative compatibility reactions between Trichoderma isolates. A) T.75 - T.78, B) T.17 - T.90, C) T. 78 - T. 13. [1^st fungus (left) - 2^nd fungus (right)]. 

La compatibilidad observada entre estas especies pudiera estar relacionada con la existencia de un complejo entre T. viride - T. atroviride (ambas pertenecen a la sección Trichoderma, según análisis por ITS) (^{Lübeck et al., 2000}). Consecuentemente, la identificación de T. asperellum por técnicas moleculares a partir de T. viride, justificó que T. atroviride y T. asperellum poseen características fenotípicas y talla del fragmento ITS muy similares (^{Hermosa et al., 2000}). Este aspecto explica la compatibilidad existente entre los aislados de estas especies. Es por ello que, algunos aislados de T. atroviride o T. viride se reclasificaron como T. asperellum (^{Sánchez-García et al., 2017}).

En relación con esto, ^{Stocco (2014)} demostró que entre las especies de la sección Trichoderma, que incluye a T. viride, más de una especie puede compartir la misma secuencia de SSU (gen de la pequeña subunidad 18S), lo que indica pocas diferencias entre estas. No se conoce si esta región está correlacionada con la Cv, y que, a ello, se deban los resultados obtenidos. Independientemente, la evaluación de la Cv tiene importancia para la identificación de aislamientos (^{Galdames, 2001}).

Teniendo en cuenta la compatibilidad vegetativa que mostraron los aislamientos en estudio con las cepas de referencia T. asperellum 215D, T. atroviride IMI206040 y T. viride, se puede inferir, que estos tienen relación taxonómica con cualquiera de las tres especies antes mencionadas.

^{Cook y Baker (1983)} con el uso de esta técnica (Cv) confirmaron la identificación taxonómica de aislados de Trichoderma realizada previamente por ellos, a partir de aspectos morfológicos. En relación con esto, ^{Galdames (2001)}, opinó que este tipo de bioensayo (“prueba de compatibilidad”) puede ser considerado como un criterio de clasificación de las especies del género Trichoderma, debido a la consistencia de los resultados, al comparar el agrupamiento obtenido entre 21 cepas de Trichoderma spp., por técnicas moleculares (RAPD y AFLPs) y la Cv.

De forma general, esta prueba demuestra que cepas de una misma especie del hongo comparten patrones similares de compatibilidad, lo que se reduce entre especies más alejadas. Por tal motivo, puede ser considerada como una alternativa, simple y rápida para valorar la especie a que pertenece un nuevo aislado, siempre y cuando se cuente con cepas de diferentes especies correctamente identificadas molecularmente.

Desde el punto de vista práctico, es importante, ya que tiene implicación en la formulación de productos biológicos cuyo ingrediente activo es este antagonista y donde se utilicen consorcios de especies, debido a que algunos de ellos pueden inhibir al otro, sobre todo debido a liberación de compuestos no-volátiles (^{Lelay et al., 2007}). Algunas investigaciones aclaran que cuando se aplica un consorcio de microorganismos de la misma especie (relación intraespecífica) o de especies diferentes (relación interespecífica) se podría obtener mayor inhibición de los patógenos, así como proporcionarle beneficios a la planta (^{Moo koh et al., 2018}). En este sentido, ^{Gallegos-Morales et al. (2022)}, evidenciaron compatibilidad in vitro entre T. asperellum, T. harzianum y Trichoderma lignorum; y al realizar co-aplicaciones tuvieron hasta el 86 % de rendimientos por planta, y disminución en la incidencia (71 %) y severidad por Fusarium sp., (59 %) en el cultivo de Chile (Capsicum annuum L.).

Variabilidad molecular de los aislamientos

Análisis RAPD

Los 11 marcadores generaron un patrón de amplificación claro y reproducible para cada aislamiento, con un total de 92 bandas reproducibles. De estas, 65 fueron polimórficas, para un 70,7 % de polimorfismo. Los iniciadores OPA-13, OPB-07, OPB-09, OPH-19 y OPJ-20 tuvieron 70 o más porciento de polimorfismo (Tabla 3), destacándose el OPH-19 con 100 % de polimorfismo.

Los datos generados por los RAPD formaron cuatro grupos, una evidencia más de la variabilidad intraespecífica entre los aislados en estudio (Figura 7).

Figura 7 Agrupamiento de cinco aislados de Trichoderma basado en el polimorfismo por RAPD por el método de Jaccard. 

Figure 7: Clustering of five Trichoderma isolates based on polymorphism by RAPD by Jaccard’s method. 

La variabilidad obtenida por RAPD entre los aislados puede ser usada para la detección de estos. El iniciador OPE-14 amplificó una banda en el aislado T.17 que lo diferencia de T.13, para T.75 con el iniciador OPH-03 se produjeron tres bandas que lo diferencian de T.78, y OPH-19, produjo una banda en T.17 que lo distingue del resto de los aislados (Figura 8). Diferencias que puntualizan dicha variabilidad. Desde otro punto de vista, estos resultados tienen importancia para el diseño de cebadores específicos, para su identificación, aspecto primordial para la autenticación, protección, y monitoreo de estos en campo.

Figura 8 Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % en TBE de la amplificación con cebadores RAPD. Línea 1: M (1000 pb DNA Ladder, Invitrogen, E.U.); Líneas 2-6: Aislamientos de Trichoderma en estudio. 

Figure 8: Electrophoresis on 1.5 % agarose gel in TBE of the amplification with RAPD primers. Lane 1: M (1000pb DNA Ladder, Invitrogen, E.U.); Lanes 2-6: Trichoderma isolates under study. 

Resultados similares obtuvieron ^{Chandulal et al. (2016)}, quienes encontraron con cinco iniciadores RAPD variabilidad intraespecífica entre diez aislados de Trichoderma sp., obtenidos de suelo rizosferico de tomate (Solanum lycopersicum L.). También, ^{Ranga et al. (2017)} detectaron elevada variabilidad intraespecífica en nueve aislados de Trichoderma, con el uso de 15 iniciadores. Asimismo, coinciden con los obtenidos por ^{Hernández et al. (2013)}, quienes con el uso de cuatro iniciadores RAPD evidenciaron variabilidad intraespecífica en diez aislados de Trichoderma spp. También, ^{Hewedy et al. (2020)} revelaron un elevado polimorfismo de 80 % de las bandas reproducibles en las cepas con siete iniciadores RAPD.

Por su parte, ^{El_Komy et al. (2015)}, encontraron elevada variabilidad intraespecífica en 30 aislados de T. asperellum, con ocho cebadores RAPD, aunque esto no se relacionó con la actividad quitinasa y glucanasa de estas cepas. En sus investigaciones ^{Kumar y Sharma (2011)} declaran que, la variabilidad detectada con marcadores RAPD se relaciona con otros marcadores, fisiológicos o patogénicos. Los resultados del ensayo coinciden con los informado por estos autores, aunque parcialmente con los de ^{El_Komy et al. (2015)}, ya que los aislados de Trichoderma cubanos, presentan marcada variabilidad enzimática (^{González et al., 2012}).