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Revista mexicana de fitopatología

versión On-line ISSN 2007-8080versión impresa ISSN 0185-3309

Rev. mex. fitopatol vol.37 no.1 Texcoco ene. 2019  Epub 21-Ago-2020

https://doi.org/10.18781/r.mex.fit.1810-5 

Reportes fitopatológicos

Primer reporte de Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) en Michoacán, México

José Manuel Cambrón-Crisantos1 

Johan Rodríguez-Mendoza*  1 

Jessica Berenice Valencia-Luna1 

Salomé Alcasio Rangel1 

Clemente de Jesús García-Ávila1 

José Abel López-Buenfil1 

Daniel Leobardo Ochoa-Martínez2 

1Dirección General de Sanidad Vegetal-Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria. Carretera Federal México-Pachuca, Km 37.5, CP 55740 Tecámac, Estado de México, México

2Postgrado en Fitosanidad-Fitopatología. Colegio de Postgraduados Km. 36.5 Carretera México-Texcoco, CP 56230, Montecillo, Texcoco, Estado de México


Resumen

A nivel mundial, la producción de jitomate y chile es de gran relevancia. Recientemente, en Israel y Jordania se notificó la presencia de un nuevo miembro del género Tobamovirus en plantaciones de jitomate, al cual se le llamó Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV). Los frutos de plantas infectadas manifiestan áreas amarillas, necróticas o de color marrón incluso rugosidades. En los municipios de Yurécuaro y Tanhuato, Michoacán, se han observado cultivos de jitomate y chile con síntomas similares a los antes mencionados por lo que el objetivo del presente trabajo fue determinar si el ToBRFV se encuentra presente en estas localidades. Se colectó tejido foliar de jitomate con síntomas y se realizó RT-PCR con iniciadores que amplifican un segmento del ORF2 del genoma de este virus; además, se prepararon rejillas para su observación al microscopio electrónico de transmisión (MET). Se obtuvo el amplicón esperado y las secuencias tuvieron una similitud de 99 a 100 % con ToBRFV. Al MET se observaron partículas virales en forma de varilla rígida típicas de tobamovirus. Hasta donde sabemos este es el primer reporte de la presencia del ToBRFV asociado a plantas de jitomate y chile cultivados en México.

Palabras clave: Tobamovirus; Solanaceae; RT-PCR; microscopía electrónica de transmisión

Abstract

The production of tomato and pepper is of great importance worldwide. Recently, in Israel and Jordan, the presence of a new member of the Tobamovirus genus was reported in tomato crops, which was called Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV). The fruits of infected plants can develop yellow areas, roughness, as well as necrotic or brown areas. In Yurecuaro and Tanhuato municipalities of Michoacan, crops of tomato and pepper have shown symptoms similar to those described, thus the objective was to determine if the ToBRFV is present in those places. Leaf tissue of tomato with symptoms was included and RT-PCR was performed with primers that amplify a segment of the ORF2 of the genome of this virus; further, grids were prepared for observation under the transmission electron microscope (TEM). The expected amplicon was obtained and the sequences had a similarity of 99 to 100 % with ToBRFV. At the TEM, rigid rod-shaped viral particles typical of tobamoviruses were observed. To our knowledge, it is the first report of the presence of ToBRFV associated to tomato and pepper plants grown in Mexico.

Key words: Tobamovirus; Solanaceae; RT-PCR; transmission electron microscopy

De acuerdo a Dombrovsky y Smith (2017) el comercio mundial de semillas ha contribuido a la transmisión y diseminación de brotes de nuevas enfermedades en diferentes países, particularmente de virus pertenecientes al género Tobamovirus, entre ellos el ToBRFV. Los cultivos de tabaco, jitomate y chile (familia Solanaceae) son afectados severamente por virus del género Tobamovirus: Tobacco mosaic virus (TMV), Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV), Tomato mosaic virus (ToMV) y Pepper mild mottle virus (PMMoV) (Dombrovsky y Smith, 2017).

Las especies del género Tobamovirus son partículas de varilla rígida, poseen un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo de ~6.4 kb con cuatro marcos de lectura abierto (ORFs por sus siglas en inglés de Open reading frames). El ORF1 y ORF2 están separados por un codón de paro y codifican dos proteínas relacionadas con la replicación del virus con un peso de 126 y 183 kDa, respectivamente. El ORF3 codifica la proteína de movimiento de 30 kDa, mientras que el ORF4 codifica para la cápside de 17.5 kDa (Luria et al., 2017).

Los tobamovirus se transmiten fácilmente de forma mecánica y semilla (partículas infecciosas en la testa) que al germinar infectan las plántulas. El virus puede permanecer en residuos vegetales y suelos contaminados con virus durante varios meses y en semillas infectadas durante varios años (Dombrovsky y Smith, 2017).

Recientemente en Israel (Luria et al., 2017) y Jordania (Salem et al., 2015) se reportó un nuevo tobamovirus denominado Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) infectando jitomate, el cual ocasiona una reducción en la cantidad de flores y frutos, necrosis en el pedúnculo del fruto y hojas del cáliz. En los frutos de plantas enfermas se observan áreas de color amarillo o marrón y rugosidades en su superficie (Salem et al., 2015).

En 2018, productores de jitomate y chile de la región de Yurécuaro y Tanhuato, Michoacán, han reportado síntomas en frutos con coloración amarilla, manchas verdes y deformación, estriado verde y manchas irregulares color marrón (Fig. 1a) y en hojas síntomas de mosaico, moteado y amarillamiento. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue determinar si el ToBRFV se encuentra presente en Yurécuaro y Tanhuato, Michoacán, afectando los cultivos de jitomate y chile.

La presente investigación se llevó a cabo en las instalaciones del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria. En septiembre de 2018, en los municipios de Yurécuaro y Tanhuato, Michoacán, se colectó tejido foliar, flores y frutos de plantas de jitomate y chile con síntomas de la enfermedad: frutos con coloraciones amarillas, manchas y estriados verdes, manchas irregulares de color marrón y deformación, mientras que en el follaje, moteados cloróticos y mosaicos. En flores no se observaron síntomas de acuerdo a lo reportado por otros autores. En Yurécuaro se tomaron dos muestras simples dirigidas de plantas de jitomate de diferentes unidades de producción y en Tanhuato seis muestras (cinco de jitomate y una de chile). Las muestras fueron debidamente identificadas y trasladadas al laboratorio donde fueron resguardadas a 4 ˚C hasta su análisis.

De cada muestra, se separó la nervadura central de las hojas y se les realizó un corte trasversal para dividir la muestra en dos partes: la primera se utilizó para la preparación de rejillas y observarlas al microscopio electrónico de transmisión, y la segunda para la extracción de RNA total.

Se maceró 0.1 g de nervadura central de hojas infectadas en 500 µL de agua bidestilada con un pistilo de plástico estéril; el macerado fue centrifugado a 9000 g durante tres minutos para eliminar restos de tejido vegetal. Sobre rejillas de cobre de 300 mallas (Electron Microscopy Sciences®) recubiertas con una membrana de formvar/carbon® se colocaron 10 µL de sobrenadante y 10 µL de ácido fosfotúngstico al 1 % (Fluka analytical), se mezclaron por pipeteo y se dejaron durante 30 segundos, al término de los cuales se eliminó el exceso con un pedazo de papel filtro. Las rejillas se observaron por microscopia electrónica de transmisión y las imágenes fueron fotografiadas.

El RNA total se extrajo a partir de 100 mg de nervaduras centrales con el Kit SV Total RNA Isolation System Start-Up® (Promega™), de acuerdo a las indicaciones del fabricante. La pureza y concentración del RNA extraído se cuantificó por espectrofotometría (Nano Drop 2000®, Thermo Scientific™).

La retrotranscripción se realizó con iniciadores aleatorios (Random Hexamer, Invitrogen™), siguiendo las indicaciones del fabricante con las siguientes condiciones de amplificación: 1 ciclo a 42 ˚C por 30 min, 1 ciclo a 99 ˚C por 5 min y finalmente a 12 ˚C durante 5 min. En la PCR se usaron los iniciadores F-3666 (5´-ATGGTACGAACGGCGGCAG-3´) y R-4718 (5´-CAATCCTTGATGTGTTTAGCAC-3´) que amplifican un fragmento de 1052 pb del ORF2 (Luria et al., 2017). La mezcla de reacción consistió en 12.5 µL de Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix (2X) (Invitrogen), 5 µL de Super FiTM GC Enhancer (5X) (Invitrogen), 3 µL de agua grado biología molecular (Invitrogen), 1.25 µL del primer F-3666 (10 µM), 1.25 µL del primer R-4718 (10 µM) y 2 µL del templado de cDNA, en un volumen final de 25 µL. La amplificación se llevó bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo de 98 ˚C por 5 min, 25 ciclos a 98 ˚C por 1 min, 62 ˚C por 3 min y 72 ˚C por 3 min con una extensión final a 72 ˚C por 10 min. Los productos amplificados fueron visualizados en un gel de agarosa al 1.5 %.

Los productos de la RT-PCR fueron secuenciados en el Laboratorio de Biología Molecular del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, utilizando el equipo Applied Biosystems modelo 3130; las secuencias obtenidas fueron ensambladas y editadas para obtener tamaños de 900 pb y comparadas en la base de datos del GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome). El alineamiento local se realizó utilizando el programa MEGA v7.0.26 y el algoritmo MUSCLE. Se construyó una matriz con secuencias de Tobacco mosaic virus (TMV), Tomato mosaic virus (ToMV) y Tomato mottle mosaic virus (ToMMV) para realizar un análisis filogenético. Se usaron como grupo externo dos secuencias correspondientes a Pepper mild mottle virus (PMMoV) (NC_003630.1) y Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV) (AB078435.1). Se usó el método Maximum Likelihood (ML) basado en el modelo de Tamura-Nei, con 1000 iteraciones de bootstrap. Los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando los algoritmos Neighbor-Join y BioNJ a una matriz de distancias por pares estimadas utilizando el enfoque Maximum Composite Likelihood (MCL) y seleccionando la topología con un valor de verosimilitud log superior con el programa MEGA v7.0.26.

Los síntomas en frutos y plantas de jitomate colectadas en Yurécuaro y Tanhuato fueron similares a los reportados por Luria et al. (2017) y Salem et al. (2015) (Figura 1a). Las muestras analizadas amplificaron el producto esperado de 1052 pb. Las secuencias obtenidas de las muestras M1 (MK273183), M2 (MK273184), M5 (MK273187) y M7 (MK273189) tuvieron 100 % de identidad con las secuencias de las muestras identificadas en Israel (KX619418.1) y Jordania (KT383474.1), mientras que las muestras M3 (MK273185), M4 (MK273186), M6 (MK273188) y M8 (MK273190) mostraron 99 % de identidad con las secuencias de Israel y Jordania. (Figura 1b).

En el árbol filogenético con la mayor probabilidad de registro (-2680.43) se observa que las secuencias de las muestras M1-M8 se agruparon dentro del nodo que tiene las secuencias de Israel (KX619418.1) y Jordania (KT383474.1) (Figura 1c). Todos los grupos correspondientes a las otras especies de Tobamovirus tienen porcentajes de inferencia del 90 - 100 % a partir de 1000 iteraciones bootstrap. En las rejillas preparadas con extractos de hojas de jitomate se observaron partículas virales en forma de varilla rígida de aproximadamente 300 nm de longitud similares a las reportadas por Luria et al. (2017) (Figura 1d).

Estos resultados indican la presencia de Tomato brown rugose fruit virus asociadas a plantas de jitomate y chile colectadas en Yurécurao y Tanhuato y sugieren que proceden de semilla comercial producida en Israel y Jordania. El ToBRFV solo ha sido reportado en Asia y Medio Oriente y se tienen reportes sobre su fácil diseminación mecánica y por semillas (Dombrovsky y Smith, 2017). Con base a los resultados obtenidos, se considera necesario que en el futuro se realicen las pruebas de patogenicidad correspondientes.

Figura 1 Síntomas observados en frutos de jitomate positivos al ToBRFV. Frutos con coloraciones amarillas (a), manchas verde y deformación (b), estriado verde (c) y frutos con manchas marrón (d). Productos de 1052 pb obtenidos por RT-PCR utilizando los oligonucleótidos para el género Tobamovirus (e). Árbol de máxima probabilidad de las se cuencias del fragmento ORF2 de muestras ToBRFV con otros Tobamovirus (TMV, ToMMV y ToMV) (f). Partícula viral en forma de varilla rígida presente en muestras de jitomate característico de Tobamovirus (g). 

Conclusiones

De acuerdo con los resultados obtenidos en la presente investigación se establece que el Tomato brown rugose fruit virus se encuentra asociado a plantas de jitomate y chile de cultivos comerciales en los municipios de Yurécuaro y Tanhuato, Michoacán. Estas plantas presentaron los síntomas descritos por Luria et al. (2017) y Salem et al. (2015).

Agradecimientos

A los ingenieros José Antonio Castro Mora y Jorge Torres Faburrieta del Programa de Vigilancia Epidemiológica Fitosanitaria del Estado de Michoacán por el apoyo para la colecta de plantas en campo. A la Dra. Rosario Espinoza Mellado de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN por la asistencia técnica para la toma de imágenes de microscopía electrónica.

Literatura citada

Dombrovsky A and Smith E. 2017. Seed Transmission of Tobamoviruses: Aspects of Global Disease Distribution. pp: 234-260. In: Jose C. Jimenez-Lopez (ed.). Seed Biology. IntechOpen. 338p. http://doi.org/10.5772/intechopen.70244 [ Links ]

Luria N, Smith E, Reingold V, Bekelman I, Lapidot M, Levin I and Dombrovsky A. 2017. A new Israeli Tobamovirus isolate infects tomato plants harboring Tm- 22 resistance genes. PLoS ONE 12(1): 1-19. http://doi. org/10.1371/journal.pone.0170429 [ Links ]

Salem N, Mansour A, Ciuffo M, Falk BW and Turina M. 2015. A new Tobamovirus infecting tomato crops in Jordan. Archives of Virology 161(2): 503-506. http://doi.org/10.1007/s00705-015-2677-7. [ Links ]

Recibido: 29 de Octubre de 2018; Aprobado: 06 de Diciembre de 2018

*Autor para correspondencia: rodriguezmj@cinvestav.mx

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